C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定
Summary
このプロトコルの目標はオンカラム細胞外の電子受容体を用いたトランス プラズマ膜電子輸送を監視し、これらの細胞外の電子アクセプターに発生する酵素の相互作用を解析します。
Abstract
トランス プラズマ膜電子輸送 (tPMET) は、細胞の酸化剤によって損傷からの保護と同様に、細胞内還元ストレスからの細胞の保護の役割を果たします。細胞の酸化細胞内還元剤から電子を輸送のこのプロセスはよく定義されません。細胞外の電子受容体を用いた tPMET を監視する C2C12 細胞によって吸光光度アッセイを紹介: 水溶性テトラゾリウム塩 1 (WST-1) と 2, 6 ‐ ジクロルフェノールインドフェノール (プラズマまたはなった)。これらの電子アクセプターの削減、リアルタイム解析で、このプロセスを監視することがおります。アスコルビン酸オキシダーゼ (AO) やスーパーオキシドディスムターゼ (SOD) アッセイなどの酵素のほか、tPMET のどの部分がアスコルビン酸のエクスポートまたはスーパーオキシド生産、それぞれを判断できます。WST 1 は、低バック グラウンドで安定した結果を生成する示されていたプラズマ AO と吸光光度分析と実証された SOD の付加の後で再酸化することができた。このメソッドは、吸光光度法がリアルタイム、マルチも、クイック フェリシアン (FeCN) フェリチト クロム c 削減などの tPMET を監視するために使用他の方法上の利点を示します。
Introduction
精製膜の電子受容体を減らす機能は、ビュー固有の酸化還元能力1は、細胞膜につながっています。動物、植物、菌類に見られる以前、tPMET、複数生物2,3,4,5一般的なプロセスです。具体的には、このプロセスは、酵母、ニンジン培養細胞、赤血球、リンパ球、骨肉腫、悪性黒色腫、大食細胞、骨格筋、好中球2,3、で実証されています。4,5,6,7. 細胞酸化を減らすために原形質膜の間で電子を輸送するプロセスで tPMET を含む多くの細胞機能に関与している: セル成長5,8, 細胞生存率9, 鉄代謝10、セルシグナ リング11,12,13、および活性酸素種12,14,15からの保護。TPMET の不均衡ががん16, 心血管疾患17を含むいくつかの深刻な健康状態の発展に貢献するという仮説が tPMET のおかげで多くの細胞機能と代謝症候群18。
血しょう膜の間で電子の移動を監視する複数の方法がありますが、最も広く使用されている手法は、比色試金を介して細胞外の電子アクセプターの削減を評価します。一般的に使用される細胞外電子アクセプターはテトラゾリウム塩、プラズマ、FeCN、フェリチト クロム c19,20。最も一般的に使用されるテトラゾリウム塩は、WST 119の第二世代塩知られています。この化合物は 2 つスルホン酸のグループがあり、その水への溶解度21になるため最初の世代テトラゾリウム塩と比較して比色試金で使用する簡単です。WST-1 中間電子アクセプター 1-メトキシ-フェナチン methosulfate (Mpm) と組み合わせて、2 つの単電子転送イベントに削減されます。この減少は、WST 一色弱酸化型をより強烈な黄色の塩20,22に変更します。WST 1 が 37 × 103 M-1cm-1、高モル吸光係数高い測定感度21,22に 。プラズマはまた tPMET を監視するため細胞外の電子受容体として利用されています。これは、プラズマが tPMET 中間電子アクセプター23,24の援助なしで細胞外に減らすことが示されています。中間電子アクセプターの不足、プラズマは直接ピックアップ WST 124とは異なり、細胞膜から電子ことができます。プラズマと同様に、FeCN は細胞外 tPMET 中間電子アクセプター19,24の助けを借りずにフェロシアン化する縮小する示されています。WST 1 やプラズマと違って FeCN が低いアッセイ感度9につながる低分子吸光係数です。TPMET を監視するもう一つの一般的に使用される細胞外電子アクセプターは、フェリチト クロム c 中間電子アクセプター、Mpm22使ってフェリチト クロム c 削減増加、WST 1 と同様です。WST 1 とは異なり、フェリチト クロム科学的方法は高いバック グラウンド化低分子吸光係数22敏感。
吸光光度法による tPMET のリアルタイム解析法をご紹介します。メソッドは、使用されますが一般的、他と比較されて安価フェリチト クロム c など細胞外の電子アクセプター、両者は高分子吸光係数を持っている WST 1、プラズマ、細胞外の電子受容体を利用しました。フェナジン methosulfate (PMS) 利用 Mpm の代わりに類似した化学構造、PMS ははるかに高価です。Mpm は光化学安定した長い貯蔵寿命を必要があります市販キットの重要な特徴であります。しかし、我々 PMS 新鮮なを確認各試金のための安定性の問題をすべきではないです。酵素間の相互作用 (図 1を参照) さらに tPMET のプロセスを特徴付けるために利用されるかもしれない酵素と細胞外の電子受容体を評価する方法を提案する.具体的には、AO と SOD を使用ことができます酵素アスコルビン酸輸送や細胞のスーパーオキシド リリースでは、膜の間で運ばれる電子の 2 つの一般的な方法は、tPMET のどの部分を決定します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は、C2C12 細胞に tPMET を監視する吸光光度アッセイでの細胞外の電子アクセプター、WST 1、プラズマを利用するための 2 つの方法を提示しています。標準培養プロシージャのセルラインの成長と分光光度計プレート リーダー、単純なマイクロ プレート法でこれらの電子アクセプターと tPMET を監視することが可能です。WST 1 削減は、アッセイ内の井戸-井戸から再現が、日々 変動がありま?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼らのテクニカル サポートのトーマス ・ ベル、リン Mattathil、マーク Mannino、Neej patel さんに感謝したいと思います。この作品は、米国公衆衛生サービス賞 R15DK102122 国立糖尿病・消化器・腎臓病 (NIDDK) からジョナサンフィッシャーによって支えられました。原稿内容は著者の責任し、もの、NIDDK または健康の国民の協会の公式見解ではありません。
Materials
| C2C12 myoblasts | American Type Culture Collection | CRL-1772 | |
| Dulbecco's modified eagle's medium – low glucose | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex animal serum complex | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | 516106 | |
| horse serum | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| 15 cm culture dishes | TPP | 93150 | |
| 96 well culture plates | TPP | 92096 | |
| 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium Sodium Salt (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| phenazine methosulfate | Sigma | P9625 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| ascorbate oxidase | Sigma | A0157 | |
| superoxide dismutase | Sigma | S5395 | |
| 2,6-dichloroindophenol sodium salt | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| HEPES sodium salt | Sigma | H3784 | |
| sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| potassium chloride | Fisher Scientific | BP366 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M5921 | |
| calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | |
| potassium phosphate | Fisher Scientific | BP363 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Powerwave X-I spectrophotometer | Biotek Insturments | discontinued | |
| Spectronic Genesys 5 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 336001 | |
| PureGrade 96-well microplate, F-bottom, clear, untreated, non-sterile | MidSci | 781602 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 220299 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma | 215422 | |
| hypoxanthine | Sigma | H9636 | |
| xanthine oxidase | Sigma | X4500 | |
| Excel | Microsoft | ||
| R Studio | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek Insturments | discontinued |
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