Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo

Questo manoscritto descrive una procedura pratica per lo studio della memoria immunitaria umana responses in vivo, utilizzando antigene cutaneo delle cellule e richiamo raccolto tramite induzione aspirazione blister. TST è stato utilizzato come esempio di deposizione di antigene intradermica e richiamo del vaccino di BCG. Infine, un esempio di SB esemplare caratterizzazione mediante analisi di flusso cytometric e multisala citochina è stata fornita, che dimostrano che circa un terzo delle cellule SB erano polifunzionale di antigene-specifiche cellule T del fenotipo memoria effettrici.

I passaggi critici del presente protocollo comprendono la tecnica di iniezione intradermica, l’induzione di aspirazione blister e la puntura della bolla. In primo luogo, una corretta deposizione intradermica richiede personale specializzato. Una deposizione non corretta può portare a risultati non ottimali. PPD è generalmente un antigene cutaneo ben noto e sicuro, ma la sua composizione può variare tra produttori, limitando la comparabilità^13,20. Questo rapporto fornisce le istruzioni per una singola deposizione intradermica di 2 TU e facoltativamente due deposizioni parallele (2 x 2 TU), che possono richiedere ulteriore approvazione etica. Tuttavia, altri studi hanno utilizzato 10 TU, che aumentano la probabilità di una pelle forte reazione^10,21. Durante la fase di induzione di SB, piccolo aumento graduale della pressione negativa ridurrà il rischio di rottura di emorragia e sul blister. Le possibilità di contaminazione con globuli rossi o leucociti dal sangue sono generalmente basso². La tecnica di puntura asettica previene la contaminazione microbica ed evitando il contatto tra l’ago puntura e il pavimento della bolla cutanea riduce le impurità di detriti o di cellule cutanee residenti. Tuttavia, alcuni ricercatori preferiscono raccogliere il fluido SB applicando una pressione di rotolamento per il blister perforato¹⁰. Può essere necessario forare i setti all’interno del blister. La stessa tecnica di SB è minimamente invasiva; SBs compresso guariscono senza cicatrici e infezioni sono molto rare. ² tuttavia, può verificarsi un certo grado di ipo-pigmentazione e induzione di SB dovrebbe probabilmente essere evitato in persone con una storia di colloide cicatrici.

Limitazioni tecniche includono basso cellulare totale rendimenti e conseguenza limitati opzioni per l’archiviazione a lungo termine. Le relazioni tra la resa del leucocita, le risposte cliniche di TST, la dimensione della bolla e contaminazione dell’eritrocito è stato accuratamente descritto altrove^2,10. Negli esperimenti BCG-richiamo qui presentati (Figura 1), la resa totale mediana da ogni blister era 50.000, implicando un set-up sperimentale e su piccola scala, utilizzando queste cellule, soprattutto se SBCs sono studiati da solo¹⁵. Tuttavia, la popolazione di cellule T specifica in un campione di SB supera per lo più quello che è trovato in campioni di PBMC in entrambi i conteggi relativi e assoluti delle cellule. Nell’esempio presentato nella Figura 2, il numero di cellule T specifiche PPD triple-positivi in un campione di 100.000 SB cellule era più di 2 x maggiore rispetto al numero trovato in 1 x 10⁶ PBMCs dallo stesso donatore (dati non mostrati). Un segnare visivo della reazione TST è il più comune metodo clinico per la valutazione della memoria di M. tuberculosis . Della nota, la reazione immunologica adattiva sottostante non picco allo stesso tempo come la clinica pelle reazione^2,21. Non tutti i vaccinati BCG o Mtb-gli individui esposti svilupperà forti reazioni di TST e strategie per la classificazione e una gestione dei campioni da TST non-responder, come pure una preesistenza sensibilizzazione micobatterica nella popolazione di studio, devono essere considerati prima di iniziare un processo di richiamo utilizzando questo metodo. Inoltre, in entrambi campionamento SB e segnare visivo, c’è un potenziale per una polarizzazione teorica in individui con le risposte di pelle riduttrice dovuto globale o dermo-affine alterato l’immunità, come si è visto, per esempio, l’infezione da HIV e determinate fasce di età^{2, 13,18,20}. Inoltre, un’amplificazione immunologica della reazione con ripetuti test TST è ben noto^20,22. Tuttavia, i fenotipi cellulari SB rimangono piuttosto costanti quando TSTs sono ripetute¹⁰. Questa osservazione sostiene il ruolo di richiamo di SB in studi longitudinali delle risposte immunitarie cellulari.

Per immunologi T-cellula, richiamo SB permette la raccolta delle frazioni alte di cellule antigene-specifiche. Tuttavia, i tempi di SB per un campionamento da un PPD-deposizione sono critico come sia la composizione cellulare e il microambiente di citochina cambiano nel tempo. In questo protocollo, vesciche erano indotto 7 giorni post-sfida e le cellule isolate erano principalmente CD4 + effettrici cellule T di memoria tra cui alte frazioni delle cellule con una co-espressione di IFN-γ, TNF-α e il-2. Queste osservazioni sono in linea con precedenti studi che descrivono come attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T si verifica nella pelle di PPD-innescato^2,15,21. Studi cinetici di SB in individui sensibilizzati PPD suggeriscono che la risposta di pelle molto precoce è aspecifica; Tuttavia, già entro i primi giorni dopo la sfida di PPD, la risposta diventa dominata da T-cells CD4 + (entrambi fenotipi di memoria memoria ed effettrici centrali sono state descritti) e, dopo 3 giorni, la risposta è dominata da alte frazioni di PPD specifiche citochine producendo i T-cells di CD4 +^2,8,10,15,21. Questa risposta adattativa citochina rimane rilevabile per più di 2 settimane^2,8,10,23. Giorno 7 post-TST sembra essere il punto di tempo ottimo per la raccolta della citochina producendo le cellule di T di memoria CD4 +². Tuttavia, altri punti di tempo possono, naturalmente, essere pertinenti a seconda dell’antigene e la risposta di interesse. Da notare, in uno studio, la risposta adattativa di PPD è stata segnalata per un po’ prima di picco con una diminuzione della secrezione di citochina pro-infiammatoria già a 5 giorni post-TST¹⁰.

SB liquido contiene alti livelli di citochine pro-infiammatorie e di altre proteine indicati per essere rappresentante della pelle microambiente^15,24. Studi di cinetica hanno dimostrato che TNF-α e IFN-γ livelli nel picco fluido SB dopo 3 giorni mentre il picco dei livelli IL-2 dopo 7 giorni^2,10, probabilmente riflettendo la dominanza di risposte adattative in questa fase successiva. Perché le cellule SB sono stati attivati in vivo, esibiscono un rilascio di citochine spontaneo alta così come un potenziale per un rilascio specifico su restimolazione (Figura 3 e 4).

Questa relazione si concentra sulla immunità delle cellule T CD4 +. Come dimostrato nella Figura 2, la maggior parte delle T-cellule isolate era infatti CD4 +, mentre non c’erano quasi nessun CD8 + cellule T nell’aspirazione blister fluido. Questo è in linea con altri studi di SB PPD-richiamo reporting proporzioni basse e un’inferiore capacità migratoria delle T-cellule CD8 + rispetto a cellule T CD4 +^2,8,10,23. Un’ulteriore caratterizzazione del CD8 + contributo sarebbe preferibile; Tuttavia, questo esula dall’ambito della presente relazione.

Le cellule T sono considerate essenziali per il controllo immune di Mtb; Tuttavia, è stato difficile identificare un affidabile correlato della tutela riflettuto nella risposta immunitaria adattativa dal sangue^25,26. Questo blocco impedisce gravemente lo sviluppo di nuovi vaccini di TB, come attualmente non esiste alcuna alternativa all’efficacia di grandi dimensioni e molto costose prove²⁷. Gli sviluppatori di vaccino TB determinano l’immunogenicità del vaccino valutando cambiamenti piccoli e transitori nelle popolazioni vaccino-specifiche cellule T nel sangue^28,29. Tuttavia, è lecito chiedersi se sia rilevante la piccola frazione di cellule T antigene-specifiche nel sangue di circolazione (cioè, in grado di migrazione verso il sito di un’infezione e rappresentante del microambiente di T-cellula-ricco, il controllo Mtb) ^{27 , 30 , 31} .

Basato su studi precedenti e i dati presentati nel presente documento, il modello di richiamo cutaneo SB rappresenta un potenziale non sfruttato per lo studio delle cellule T specifiche del vaccino. Non solo il modello consente un richiamo di un vaccino risposta generata da decenni, permette anche la valutazione della memoria vera potenziale in un contesto di tessuto-specifica^15,18,19,21. Romanzo, specifici test cutanei, che includono antigeni compreso anche dei vaccini subunità TB, suggerire nuove opportunità per la valutazione del vaccino utilizzando questo modello^28,32. Inoltre, analisi trascrittomica suggeriscono che una risposta comunicata per cellule immunitarie generata nella pelle di PPD-sfidati sia simile alla risposta trovata in Mtb-infettato del polmone¹⁸.

Mentre biopsie di pelle anche consentono una raccolta delle cellule della pelle e forniscono informazioni spaziali, confrontati con campionamento SB, il metodo è più invasivo e richiede trattamento enzimatico o meccanico per preparare sospensioni unicellulari³³. Misurazioni dei marcatori delle cellule e citochine sono comparabili tra i due metodi^2,10.

Il metodo di aspirazione blister è già stato applicato in molti settori della ricerca medica oltre alla dermatologia, da solo o in combinazione con una sfida di pelle sistemica o locale. Gli esempi includono studi di sepsi, malattia linfoproliferativa associata al virus di Epstein – Barr, neuropatia diabetica, gli effetti di assunzione di glucocorticoidi e prove umane test anticorpi terapeutici o modelli per terapie mirate T-cellula^{10 ,34,35,36,37,38}.

Da un punto di vista terapeutico, il metodo di richiamo cutaneo SB offre vantaggi unici per studiare la memoria centrale di T-cellula potenziale e -da entrambi un biologiche e tecniche il punto di vista, la pelle sembra fornire un campione rilevante vano^{2, 15,18,19,21}. In particolare, rispetto al tradizionale campionamento passivo di PBMCs di circolazione, il metodo di richiamo cutaneo SB consente lo studio delle cellule T che hanno dimostrato la capacità di migrare dal linfonodo in risposta al loro antigene pertinenti e completare il locale espansione e differenziazione in un tessuto-specifica in vivo contesto^15,18,19,21.

In conclusione, il modello ha dimostrato qui potrebbe essere rilevante per i ricercatori nel campo dell’immunità adattiva umana e agenti mirati della T-cellula (cioè, nella ricerca di vaccinologia o cancro malattia infettiva). Il modello TST applicato in questo protocollo è, naturalmente, di particolare rilevanza nel campo della vaccinologia TB. Tuttavia, il concetto di base di questo modello è fortemente applicabile in altri campi di ricerca.