Levator Auris Longus Préparation pour l’examen de la Transmission neuromusculaire mammifères dans des Conditions de tension de serrage
Summary
Le protocole décrit dans cet article utilise le muscle levator auris longus (LAL) souris pour enregistrer spontanée et évoquée par le nerf des potentiels post-synaptiques (courant-clamp) et des courants (voltage clamp) à la jonction neuromusculaire. Utilisation de cette technique peut éclairer les clés dans les mécanismes de la transmission synaptique dans des conditions normales et la maladie.
Abstract
Ce protocole décrit une technique d’enregistrement transmission synaptique de la jonction neuromusculaire dans des conditions de courant-clamp et voltage clamp. Une préparation ex vivo de la levator auris longus (LAL) est utilisée parce que c’est un muscle mince permettant de faciliter la visualisation de la jonction neuromusculaire impalement microélectrode à la plaque de serrage moteur. Cette méthode permet l’enregistrement des potentiels de plaque d’extrémité de miniatures spontanée et courants (mEPPs et avaient), évoquée par le nerf endplate potentiels et courants (EPPs et EPCs), ainsi que les propriétés de la membrane de la plaque de serrage moteur. Résultats obtenus par cette méthode incluent le contenu quantique (QC), nombre de sites de libération vésiculaire (n), les probabilités de la libération des vésicules (prel), facilitation synaptique et la dépression, ainsi que la constante de temps de membrane musculaire (τ m) et la résistance d’entrée. L’application de cette technique de modèles murins de la maladie humaine peut mettre en évidence les principales pathologies dans les états pathologiques et aider à identifier des stratégies de traitement novateur. Par tension-serrage entièrement une seule synapse, cette méthode fournit une des analyses plus détaillées de la transmission synaptique actuellement disponible.
Introduction
Étude de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire permet de mieux comprendre la relation dynamique entre les systèmes musculaires, nerveux et squelettiques et est un excellent modèle pour étudier la physiologie synaptique. Le releveur auris longus (LAL) est un muscle mince, permettant au niveau des jonctions neuromusculaires à visualiser facilement. Les rapports précédents ont décrit la commodité d’utiliser la LAL pour examiner les toxines et les médicaments synaptiques et ont caractérisé les caractéristiques de type de fibre musculaire squelettique de la LAL1,2. De nombreuses études ont utilisé la LAL pour étudier la physiologie neuromusculaire3,4,5,6,7,8. Pour l’électrophysiologie, la capacité d’observer facilement les jonctions neuromusculaires LAL permet le positionnement précis des microélectrodes à la plaque de serrage moteur et réduit considérablement les problèmes de serrage d’espace dans l’enregistrement de la transmission synaptique. Enregistrements de courant-clamp des propriétés de la membrane musculaire, comme la constante de temps membranaire (τm) et la résistance d’entrée (Rde) sont facilement obtenus. En outre, ces propriétés peuvent être mesurées de fibres musculaires mêmes utilisés pour enregistrer la transmission neuromusculaire, ce qui permet une comparaison directe de la fonction synaptique pour les propriétés de la membrane musculaire. L’analyse de ces données peut fournir des clés mieux comprendre les mécanismes physiques de beaucoup de maladies neuromusculaires et d’États d’activité altérée.
Un aspect clé de la technique décrite ici est l’utilisation de voltage clamp pour enregistrements synaptiques, qui ne sont pas soumis les non-linéarités rencontrées en courant-clamp et sont indépendants des propriétés de la membrane musculaire. Avantages de l’utilisation de voltage clamp par opposition au courant-clamp pour étudier la transmission neuromusculaire ont été établis par le pionnier des efforts dans les années 19509. Sous courant-clamp, produits écologiques qui dépassent de 10 à 15 mV en amplitude ne sont pas un produit linéaire de la MAET amplitude9. Par exemple, si l’aménagement du territoire moyen est de 1 mV, un PPE de 5 mV peut être considérée comme le produit de 5 mEPPs (QC du 5) ; considérant que, un PPE de 40 mV sera le fruit de plus de 40 mEPPs. Cette non-linéarité à plus grandes EPPs se produit parce que la force motrice pour le PPE, qui est la différence entre le potentiel de membrane et le potentiel d’équilibre pour le récepteur de l’acétylcholine (~ -10 mV), diminue sensiblement pendant grands EPPs. Ce problème est évité dans les expériences de voltage clamp parce que le potentiel de membrane de muscle ne change pas au cours d’expériences de voltage clamp. Un inconvénient est que les expériences de voltage clamp sont techniquement plus difficiles à accomplir que l’enregistrement courant-clamp. Dans cette optique, McLachlan et Martin mis au point une simple correction mathématique qui prend en compte les non-linéarités en courant-clamp enregistrements EPPs10. Les corrections fonctionnent bien11,12,13, mais ce qui est important, supposent que les propriétés de la membrane musculaire n’ont pas été perturbées.
Les propriétés de la membrane musculaire sont particulièrement importantes à considérer si l’étude de conditions ou états pathologiques qui perturbent le muscle. Par exemple, le muscle squelettique du modèle transgénique R6/2 de la maladie de Huntington est hyperexcitables due à une réduction progressive dans le repos de chlorure et potassium courants14,15. En conséquence, mEPPs et EPPs sont amplifiés dans le muscle squelettique de la R6/2. Certes, d’autres facteurs peuvent modifier mEPPs et EPPs. Travailler avec un autre modèle de souris de la maladie de Huntington (R6/1) trouvé des modifications des produits écologiques qui semblent être associés à des protéines SNARE8. Afin d’évaluer les mécanismes provoquant l’altération de la transmission neuromusculaire, il serait avantageux d’éliminer les effets des propriétés de la membrane musculaire altéré en utilisant un voltage clamp. Dans une étude récente, la transmission neuromusculaire R6/2 a été étudiée dans les deux conditions de bride de tension et de courant en utilisant la technique décrite dans les présentes. L’intégralité des plateaux moteur étaient voltage clamp avec moins de 1 % d’erreur en plaçant deux microélectrodes dans la constante de la longueur de la plaque de serrage16. Il a été montré que la tension-pince et corrigé les documents courant-clamp ont donné des mesures contrastées de la transmission neuromusculaire dans le muscle R6/2. Ceci met en évidence qu’il peut être difficile à corriger EPPs pour les non-linéarités si les propriétés de la membrane musculaire ont été modifiées et montre les avantages d’obtenir des enregistrements de voltage clamp qui sont indépendants des propriétés de la membrane musculaire. Le protocole présenté ci-après est idéal pour l’examen des conditions ou des états pathologiques qui influent sur la transmission synaptique et les propriétés de la membrane postsynaptique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décrite ici est la préparation et l’utilisation de la souris muscle Lacroix pour la mesure de la transmission neuromusculaire dans des conditions de courant ou de tension-clamp. Il y a plusieurs points importants à considérer pour la dissection de la LAL. Nettoyage des excès du tissu conjonctif du sida de muscle en impalement électrode, comme les électrodes peut accrocher le tissu conjonctif quand leur positionnement pour empalement. Cependant, seulement enlever du tissu conjonctif qui peut être enlevé facilem…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Mark M. Rich et Daniel Miranda commentaires éditoriaux, Ahmad Khedraki pour aider à mettre en place cette technique et Wright State University de soutien financier (fonds de démarrage de A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Referenzen
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neurowissenschaften. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neurowissenschaften. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
