CARIP-Seq e ChIP-Seq: métodos para identificar a cromatina associada RNAs e interações da proteína-ADN em células-tronco embrionárias
Summary
Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.
Abstract
Autorenovação de células estaminais embrionárias (ES) e a diferenciação é regulada por sinais extrínsecos e intrínsecas redes de fatores de transcrição, epigenéticos reguladores e modificações pós-tradução das histonas que combinatóriamente influenciam o gene Estado de expressão de genes nas proximidades. RNA também foi mostrado para interagir com várias proteínas para regular a dinâmica da cromatina e expressão gênica. Associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguida por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq) é um novo método para o levantamento de RNAs associados a proteínas da cromatina, enquanto imunoprecipitação da cromatina, seguido por sequenciamento de próxima geração ( ChIP-Seq) é uma técnica poderosa genômica para mapear a localização de modificação pós-traducional de histonas, fatores de transcrição e modificadores epigenéticas em uma escala global em pilhas do ES. Aqui, descrevemos os métodos para executar CARIP-Seq e ChIP-Seq, incluindo a construção da biblioteca para geração de sequenciamento, para gerar o RNA global associada a cromatina e epigenomic mapas em pilhas do ES.
Introduction
Decisões de destino de células estaminais embrionárias (ES) são reguladas pela comunicação entre sinais extracelulares e uma série de reguladores transcricionais, incluindo modificadores de histona e modificação pós-tradução de caudas de histona. Essas interações facilitam a acessibilidade de cromatina e empacotamento da cromatina em um dos dois Estados: eucromatina, que é aberto e transcricionalmente ativo, e heterocromatina, que é compacto e geralmente transcricionalmente inativo. Factores de transcrição com afinidades de ligação de sequência específica de DNA e modificadores epigenéticas associado com as regiões de eucromatina a participar no controle da expressão gênica. Métodos de sequenciamento de próxima geração, incluindo ChIP-Seq1, têm sido fundamentais para mapear todo o genoma redes transcriptional que são fundamentais para ES célula auto-renovação e pluripotência2,3,4 ,5,6. Além disso, enquanto o RNA immunopreciation seguido de próxima geração sequenciamento (RIP-Seq)7 avaliações interações RNA-proteína sugerem que as proteínas de ligação do DNA interagem com RNAs de regulação transcricional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, poucos estudos têm investigado a localização de todo o genoma de RNAs associados com cromatina12, ou interações globais entre RNA e histona modificações. Há muito tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs) são uma classe de RNAs que foram encontrados para regular a atividade de proteínas da cromatina associada13,14,15. Por exemplo, a Xist é um lncRNA que regula, em células de mamíferos femininas, inativação de um cromossomo X, através do recrutamento de repressores epigenéticas16,17. No entanto, o espectro completo de RNAs associados a cromatina é desconhecido. Aqui, descrevemos um protocolo romance, associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguido por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq), para identificar a cromatina associada RNAs em uma base de todo o genoma em pilhas do ES, incluindo a preparação de biblioteca para sequenciamento de nova geração e ChIP-Seq para mapear ocupação global de modificações do histone, fatores de transcrição e epigenéticas modificadores. Ao contrário de outros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq inclui etapas de reticulação e sonication, que permitem a identificação directa das RNAs associados a cromatina. Juntos, ChIP-Seq é uma poderosa ferramenta para identificar as interações proteína-ADN de todo o genoma, enquanto CARIP-Seq é um método poderoso para o levantamento RNAs associados a componentes de cromatina.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq é um método útil para avaliar o local de interações proteína-ADN global (ex., fatores de transcrição/histona modificando as modificações de histona/enzimas e DNA) em células ES, enquanto o protocolo de CARIP-Seq recentemente desenvolvido é útil em Associação de todo o genoma de RNAs com constituintes de cromatina a interrogar. ChIP-Seq é uma ferramenta fundamental que é usada para avaliar epigenéticas paisagens de pilhas do ES e outros tipos de células. A qualidade do ChIP-Seq e bibli…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por Wayne estado Universidade, Karmanos Cancer Institute, uma concessão do nacional do coração, pulmão e sangue Institute (1K22HL126842-01A1) atribuído a B.L.K. Este trabalho utilizou o Wayne estado Universidade High Performance Computing Grid para recursos computacionais (). Agradecemos Jiji Kurup assistência com análise de dados de CARIP-Seq.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:
B.L.K. concebeu o método de CARIP-Seq, concebidos e realizados os experimentos de ChIP-Seq e CARIP-Seq, analisou os dados de sequenciamento e elaborou o manuscrito. Todos os autores leu e aprovou a versão final deste manuscrito.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
Referenzen
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