抗磷 girdin 抗体在自由漂浮小鼠空肠 Cryosections 小肠簇细胞中的应用

这里描述的所有方法都是由爱知人类服务中心发展研究研究所动物护理和使用委员会 (申请编号: M-03) 批准的。 1. 筹备工作 准备10升磷酸盐缓冲盐水 (PBS): 32.27 克 Na2HPO4· 12H2O, 4.5 克 NaH2PO4· 2H2O, 80.0 克氯化钠添加到超纯水中, 在室温 (RT) 的最后容积 10 l。 准备200毫升的 pbs t: 200 毫升的 pbs 从步骤1.1 与100µL 聚氧乙烯 (10) 对辛醚到最后浓度 0.05% (卷: 卷)。存储在 RT。 在佩戴手套和眼部保护的同时, 在10% 缓冲中性福尔马林溶液中准备50毫升15% 蔗糖: 7.5 克蔗糖添加到10% 缓冲中性福尔马林溶液 (材料表), 最终体积为50毫升。存储在 RT。注意: 吸入和/或皮肤/眼睛接触甲醛在10% 缓冲中性福尔马林溶液可能是危险的。小心处理。 准备1.5 毫升200单位/毫升罗丹明荧光染料共轭溶液: 罗丹明荧光染料共轭 (300 单位在1瓶, 冻干固体, 激发和发射波长: 581 毫微米和609毫微米分别) 悬浮在1.5 毫升甲醇.存储解决方案在黑暗中的-20 °c。 准备5毫克/毫升 4 ‘, 6-diamidino 2-苯基吲哚, 盐酸盐 (DAPI) 库存溶液:10 毫克 DAPI 在2毫升的 n, n-甲基酰胺 (DMF)。存储解决方案在黑暗中的-20 °c。 在 pbs 中制备5% 牛血清白蛋白 (bsa): 0.5 克 bsa, 10 毫升 pbs。存储在4摄氏度。 使用一个钳移除18口径直针的斜面尖端, 并将夹紧端与一个在纵向方向上的守财奴捏在一起, 使液体流经针腔 (图 1A1)。注意: 协议可以在这里暂停。 2. 空肠的动物解剖和分离 小鼠灌注固定术 戴上手套, 在通风良好的地方工作。 准备一个100毫升的玻璃烧杯, 10% 缓冲中性福尔马林溶液, 外科工具 (剪刀, 镊子), 金属托盘, 6-0 尼龙切割缝合, 18 口径直针制备为 1.7, 22 口径翅针, 20 毫升注射器。 将20毫升10% 缓冲中性福尔马林溶液从玻璃烧杯装入20毫升注射器, 并将22口径翅针连接到出口处。 将1克明胶粉加入20毫升的 PBS (最终5% 明胶), 在50毫升离心管中制备液体明胶。浸泡在 RT 15 分钟后, 在50摄氏度的水浴中孵育15分钟, 不摇晃。 简要地漩涡, 并且孵育在50°c 为另外15分钟完全地溶化明胶。把管子留在 RT 上, 直到使用。 弄死一只成年小鼠颈椎脱位。 将鼠标从步骤2.1.6 放在金属托盘上, 通过剑软骨在皮肤上做一个小切口, 使用手术工具。 用双手扩大切口, 以暴露胸腔和腹部区域。 打开腹膜以暴露隔膜, 然后打开两侧的隔膜。 将胸笼沿两侧前腋线切开, 然后在胸腺的位置横截切口以暴露心脏。 在右心房的耳廓上做一个小切口, 排出血液, 将22口径的翅针插入左心室的顶端。用10% 缓冲中性福尔马林溶液将柱塞灌注组织。 在骨盆内暴露器官后, 从肛门切除直肠的末端, 通过切开肠系膜将肠道与身体分开。 分离空肠, 从胃窦肛门侧切开4厘米的肠道。丢弃其余小肠的肛门半部分。 将空肠夹在半空, 以方便冲洗工序。将20毫升10% 缓冲中性福尔马林溶液装入20毫升注射器, 并将步骤1.7 中准备的18口径直针连接到出口。 从修剪的空肠一端注入10% 缓冲中性福尔马林溶液, 冲洗肠道内容, 修复肠道腔表面 (图 1A2)。 按步骤2.1.15 中所述的注射 PBS 冲洗肠道腔。 将液体明胶冲入肠道腔内, 如步骤2.1.15 中所述, 以液体明胶取代 PBS。 用6-0 尼龙切口缝合缝合空肠的一端, 用液体明胶填充空肠, 并用缝合结扎 (图 1A3) 关闭相反端。 添加四缝合节, 使香肠形状的空肠部分适合 cryomold 的郁闷部分 (图 1A4)。注: 对于 cryomolds 与20毫米 x 25 毫米 x 5 毫米凹陷部分, a ~ 20 毫米香肠状空肠部分是可取的。 将50毫升15% 蔗糖的组织浸泡在10% 个缓冲中性福尔马林溶液中, 隔夜在4摄氏度。注: 这些步骤确保抗冻的蔗糖和蛋白质固定的甲醛的明胶和组织。福尔马林-糊明胶不熔化在 rt, 而非固定糊明胶在4°c 融化在 rt。 3. 凝胶充填空肠组织冻结 通过在缝合节上切开空肠, 获得三个具有两端结扎的香肠状空肠 (图 1A4)。在 cryomold 中对香肠样件进行排列, 以添加嵌入化合物, 用于制备冷冻组织标本。 用液氮冷却异戊烷中的 cryomold。存储 cryomolds 在-80 °c注意: 协议可以在这里暂停。 4. 游离漂浮 Cryosections 对一簇细胞免疫荧光的研究 Cryosectioning 将恒温器室温度 (CT) 和目标温度 (OT) 设置为-22 摄氏度。将冰冻组织块放置在恒温器室的 cryomold 中, 至少15分钟。 将3毫升 PBS 添加到35毫米培养皿中。 从 cryomold 中取出冰冻的组织块, 用剃刀刀片将块切成两半, 露出空肠的横断面。将块的一半装在一个恰克 (恒温器适配器) 上, 用剃刀刀片截割平面。 将明胶充填的空肠分成30µm 厚的部分。使用冷冻钳将节轻轻地转移到在步骤4.1.2 中准备的 35 mm 培养皿中 (图 2B, 右)。 原发性抗体的应用 在35毫米培养皿中, 每3次清洗自由浮动的部分5分钟, 每个与3毫升 PBS-T 与轻微震动在一个相互的振动筛 (大约36次/分钟)。 准备抗原检索解决方案: 0.3 毫升抗原检索溶液浓缩 (材料表) 在2.7 毫升的超纯水。加入3毫升的抗原检索解决方案, 35 毫米培养皿中含有游离漂浮的部分。 关闭盖子, 用一条乙烯胶带封住盘子和盖子之间的缝隙, 在50摄氏度的杂交孵化器中孵育3小时, 不摇晃。 从孵化器中取出盘子, 在 RT 上冷却20分钟。取出乙烯基胶带后, 每段3次冲洗5分钟, 每次3毫升的 PBS 和轻微震动。 吸入 PBS 并将5滴阻塞溶液 (材料表) 添加到各节上。在 RT 中孵育5分钟, 轻度晃动。 准备主要抗体溶液: 495 µL 5% BSA 在 PBS 与5µL phospho-Y1798 girdin (pY1798) 抗体 (材料表)。将主抗体解的500µL 添加到各节 (不需要删除阻止解决方案)。 把盘子放在一个湿润的孵化室里, 在4摄氏度的时候用轻微的震动孵化一夜。注意: 夜间孵化可延长至三晚。 二次抗体的应用 在3毫升的 PBS 中, 用轻微的震动洗涤3次, 每节5分钟。 准备稀释 DAPI 库存解决方案: 2 µL 的 DAPI 库存解决方案 (步骤 1.5), 998 µL 的 PBS。 做二次抗体解决方案: 476 µL 5% BSA 在 PBS, 10.5 µL 稀释 DAPI 溶液, 12.5 µL 罗丹明荧光染料共轭股票溶液, 1 µL 山羊抗兔 IgG-荧光染料共轭 (波长: 励磁496毫微米, 发射520毫微米)。 在对 PBS 进行吸吸后, 应用二次抗体溶液, 并在30分钟内以轻度晃动的方式在光屏蔽孵化室中孵育。 用3毫升的 PBS 和轻微的震动, 每段3次冲洗5分钟。 最后清洗后, 去除 pbs T, 并更换3毫升的 pbs 缺乏聚氧乙烯 (10) 对辛醚。把盘子转到立体显微镜上。 将200µL 的 PBS 放在一个小水滴上, 并将一个空肠部分从盘子中转移到液滴上, 使用 P200 吸管尖。 调整后, 在立体显微镜下的部分对准, 吸入所有其余的 PBS 周围的部分。 添加20µL 的水上安装介质, 并在介质上放置 20 x 20 毫米盖玻片。 立即用二甲苯为基础的安装介质密封盖玻片边缘。将幻灯片放在木制 mappe 上, 并允许以二甲苯为基础的安装介质在 RT 上凝固 2-3 小时。注意: 协议可以在这里暂停。在以二甲苯为基础的安装介质固化后, 可以在 RT 的光屏蔽滑动盒中存储 2-3 周的幻灯片。 5. 共焦显微术 将浸没油放在共焦显微镜的63X 目标上。将盖玻片向下滑动, 然后将幻灯片放在舞台上。 将在激光波长405、488和 555 nm 获取的 TC 图像数字化, 并以 tiff 格式 (. tiff) 保存图像。注: 选择适合于荧光染料的检测过滤器集 (即激发/发射最大值: 358/461 nm、490/525 和 590/617)。