蛋白质消化、超滤和尺寸排除色谱法优选人血浆和血清外来体的分离

外来体是 nanovesicles (大小从30毫微米到150毫微米) 释放的几乎所有的细胞在人体内, 以促进细胞到细胞的通信进程 1, 2.有趣的是, 外来体的组成会根据原始单元格的变化以及单个3、4、5的健康状况而改变.此外, 外来体可以从几种生物液中提取, 如: 唾液、尿液和血液 2.由于这些特点, 外来体被认为是疾病生物标志物的良好来源。不幸的是, 没有标准的方法来隔离外来体。一些实验室考虑多级离心, 以 10万 x g 的最终高速步骤为外切隔离的金标准方法。然而, 最近的研究表明, 离心诱导外来体与可溶性蛋白和其他外来体的聚集, 除了影响外切完整性, 这两个可能会阻碍下游^应用程序6, 7.外切隔离的其他常用方法包括但不限于: 以商业聚乙二醇 (PEG) 为基础的试剂、离心超滤和尺寸排除色谱法 (SEC) 沉淀。使用聚乙二醇 (PEG) 聚合物的商业试剂通过使外来体沉淀并形成颗粒而丰富了它们。使用这种聚合物的限制是残留的 PEG 聚合物和大量的可溶性非 exosomal 蛋白在最终产品的污染。超滤利用纤维素膜进行离心纯化浓缩囊泡;外来体保留在过滤器之上, 而较小的杂质和其他蛋白质通过膜 7, 8.就像其他方法一样, 离心超滤由于保留高水平的非 exosomal 蛋白, 包括蛋白质复合物和聚合体, 外来体的净化能力有限。最后, SEC 净化使用多孔树脂分离分子的大小。SEC 已经显示出有希望的结果, 通过捕获大多数的污染物蛋白和保持 exosomal 完整性, 克服了其他方法所遇到的大多数问题, 因为隔离是基于重力或低压系统^{7, 9}。然而, 在 SEC 期间, 大蛋白质集料和脂蛋白的联合分离影响了最终外切制剂的纯度.虽然一些方法已经测试了外切纯化从细胞培养上清液和^等离子7, 或仅^等离子9, 11, 没有关于直接比较血液的方法的性能信息同一个人的血浆和血清。

在这里, 我们重点研究血液外来体的纯化, 通过比较各种工作流, 以确定是否囊泡浓缩技术是可翻译的血浆和血清。采用纳米微粒跟踪分析和印迹方法, 对最终产物中外切浓度、纯度和蛋白质组成的差异进行量化。最后的方法, 详细的在本协议中, 增加囊泡数和减少非 exosomal 蛋白水平。重要的是, 大量减少常见的共沉淀蛋白, 包括白蛋白和载脂蛋白。这两种蛋白质在血液中的高丰度以及它们与外来体共同纯化的频率导致了 “纯化” 样品之间的不一致, 从而扭曲了下游的分析结果。该协议包括使用商业上可用的 SEC 树脂;该树脂是由多孔珠组成, 其中蛋白质小于 700 kDa 可以进入珠。一旦内, 蛋白质由辛胺配体保留。洗脱液由外来体和大于⁷⁰⁰kDa 12 的分子组成。此外, 为了减少载脂蛋白的蛋白质聚集和抑制, 我们在工作流中加入了蛋白酶消化步骤。目前, 还没有单一的技术能够最大限度地提高外切产量, 同时减少共纯化非 exosomal 蛋白。本研究表明, 采用蛋白酶消化预处理与多种回收纯化相结合的纯化方法, 可提高血清和血浆外切的产量和纯度。