우리는 신경 세포, 대 식 세포 및에서 생리 및 병 적인 조건 하에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia 분리 프로토콜을 제시. 절연, 시 RNA 유전자 식 프로필 분석 하이 셀에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 정량 및 transcriptomics 같은 다운스트림 분석에 대 한 높은-품질 RNA의 컬렉션에 대 한 수 있습니다.
개발 또는 설립 중 다른 CNS 세포의 역할에 대 한 상세한 이해 및 두뇌 병 리의 진행을 얻으려면, 그것은 그들의 유전자 식 프로 파일을 변경 하지 않고 이러한 세포를 분리 하는 것이 중요. Zebrafish 모델 제공 많은 유전자 변형 물고기 라인 있는 특정 세포 유형 표시 됩니다; NBT:DsRed 선 또는 대 식 세포/microglia mpeg1:eGFP 라인에서 하는 예를 들어 신경에 대 한 또한, 항 체 개발 되었습니다 microglia 4C 4와 같은 특정 세포를 얼룩이 항 체.
여기, 우리 신경 세포, 대 식 세포에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 설명. 이 프로토콜은 셀룰러 프로필을 수정할 수 있는 37 ° C에서 효소 조직 소화의 회피입니다. 4 ° C에서 조직 균질의 기계 시스템 대신 사용 됩니다. 이 프로토콜 세포 현 탁 액으로 두뇌의 균질, 그들의 immuno 얼룩이 지 고 신경 세포, 대 식 세포 및 FACS에 의해 microglia의 격리를 의미 한다. 이후에, 우리는 그 세포에서 RNA를 추출 하 고 그들의 품질/수량 평가. 우리는 고품질의 RNA를 관리 (RNA 무결성 번호 (린) > 7) 세포/microglia 및 신경, 그리고 transcriptomic microglia 분석에서 정량 수행 하. 이 방법은 개발 및 pathologies에 그들의 역할에 대해 명확 하 게 이해로 서이 세포의 더 나은 특성을 수 있습니다.
두뇌 개발 및 뇌 질환에 대 한 지식을 마우스 뇌 transcriptomes1의 첫 번째 정량화 이후 지난 10 년간에서 크게 개선 했다. 실제로, 게놈 넓은 유전자 표정 분석 우리에 액세스할 뇌 조직 및 보완 하 고 관측 다른 기술 및 도구를 향상 시킬 수 있는 셀에 대 한 자세한 유전 정보.
제 브라는 쉽게 번 식 하 고 유전자; 수정 강력한 생물 학적 모델 애벌레 단계에서 광학 투명도 라이브 이미징 관찰2수 있습니다. 불행 하 게도, 인간을 비교 하 고 마우스, immuno 얼룩이 수행에 사용할 수 있는 항 체의 수는 오히려 낮은. 이 문제를 해결 하려면 유전자 변형 zebrafish 물고기 라인 쉽게 만들어집니다 유전자 물고기를 수정 하 여 셀 형식 특정 발기인에서 형광 단백질을 표현 하. 유전자 변형 zebrafish 라인 중앙 신경 시스템 (CNS) 개발 및 질병3,4,,56동안 microglia 및 대 식 세포의 역할을 공부 하는 과거에 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 프로세스의 상세한 이해를 얻기 위해 우리가 해당 셀 형식에서 유전자 발현에 변화를 이해 해야 합니다. 이 목표를 우리는 특별히 신경 세포, 대 식 세포 및 8 일 3에서 microglia 같은 세포를 분리 하는 실험 방법 개발 후 수정 (dpf) 애벌레 zebrafish 두뇌. 프로토콜의 설립에 대 한 우리 신경 신경 ß-tubulin 아래에 있는 대 식 세포 표현 유전자 발기인 (mpeg1:eGFP) 및 DsRed 세포/microglia에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 유전자 변형 물고기 라인 근무 발기인 (NBT:DsRed)7,,89. 또한, 우리는 immuno 얼룩이 microglia 4C 4, 특별히 zebrafish microglia10,11얼룩 마우스 단일 클론 항 체를 사용 하 여의 수행. 이후에, ribonucleic 산 (RNA) 추가 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 또는 transcriptome 분석에 대 한 이러한 세포에서 추출 됩니다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레;에서 뇌 조직을 효율적으로 균질 하도록 설계 되었습니다. 신경 세포, 세포/microglia 및 그들의 원형질 막 무결성의 변경 없이 microglia를 수집 하 고 마지막으로 높은 품질의 이러한 세포에서 RNA 추출 (린 > 7) 및 게놈 분석을 수행 하는 수량. 뇌 조직12,13소화를 트립 신 처리 37 ° C에서 사용 하는 연구에 대 한 이전 게시, 달리이 프로토콜 RNA 추출 단계를 줄이기 위해 유전자 식 프로필의 수정까지 4 ° C에서 작업을 촉진 합니다. 이 단계는 결정적으로 microglia 및 대 식 세포는 매우 중요 한 세포는 그들의 진 식 프로필과 분극14,15, 를 변경 하 여 즉시 그들의 microenvironment에 있는 변화에 응답 16.
세부 사항에, 여기에 설명 된 프로토콜 신경 세포, 대 식 세포 및 microglia zebrafish 애벌레 두뇌에서 거의 그것의 다른 셀에 적용할 수 있습니다 보여줍니다 뇌-유전자 변형 물고기 라인을 사용 하 여 내 제시 또는 함께 표시 특정 항 체입니다. 이 방법은 그들의 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 통해 CNS 세포의 더 나은 특성화 고 개발 및 뇌 질환 중 그들의 역할을 이해 하는 데 도움이 됩니다.
여기에 설명 된 실험 프로토콜 8 dpf에 3에서 zebrafish 애벌레에서 뇌 세포를 분리 하는 강력 하 고 효율적인 방법을 나타냅니다. 중요 한 것은, 이것은 첫 번째 프로토콜에서 애벌레 zebrafish 두뇌 microglia의 특정 격리를 허용입니다. 프로토콜은 세포 막의 무결성을 유지 하 고 처리 하는 동안 발생 하는 유전자 발현의 잠재적인 수정 최소화 하기 위해 설계 되었습니다. 이 마지막 점은 그 고립 된 세포 게놈 프로 파일의 분석에 따라 결과의 관련성에 대 한 중요 한 있습니다. 실제로, microglia 및 macrophage 분극 강하게 그들의 microenvironment에 의해 영향을 받습니다. 37 ° C에서이 세포 실험 조건 (부상 (transection) 응답)에 자신의 유전자 식 프로필을 변경 것입니다. 따라서, 그것은 이전 세포 프로세스 및 신진 대사 활동을 천천히 RNA 추출, 4 ° C에서이 실험을 수행 하는 중요 한 했다. 또한, 기계적 뇌 조직 균질 4 ° C에서 37 ° C에서 효소 조직 소화 대신 유전자 식 프로필에 어떤 영향을 피하기 위해 선정 되었다.
이 메서드는 매우 빠른; 강조 하는 것이 중요 하다 하루 내 여러 뇌 세포 인구는 적어도 두 개의 다른 실험 조건 및 그들의 RNA 추출에서 격리 될 수 있습니다. 프로토콜의 총 길이 애벌레 머리의 transection 제한 단계 (∼ 350 머리/h)으로 각 조건에 대해 사용 하는 애벌레의 수에 따라 달라 집니다. 일반적으로 3에서 microglia를 작업할 5 및 7 dpf이 좋습니다 transect ∼ 600 머리 (표 1)를 추출 하는 충분 한 RNA를 시험 당 하. Microglia 셀 형식을 나타내는 낮은 산출 (7 dpf에 인당 약 112 세포), 대 식 세포 (7 dpf에 인당 약 170 세포)를 포함 하 여 다른 세포 유형 머리의 수를 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜의 또 다른 장점은 FACS 정렬 설정이 설정 된 후 동일한 설정을 사용할 수 있는 다양 한 실험에 대 한. 그것은 세포 인구 맞는 완벽 하 게 한 실험에서 다른 이전 설계, 게이츠와 함께이 메서드를 사용 하 여 실험의 재현성을 보여주는 관찰 되었습니다.
이 방법의 약간의 불리는 수확 하는 RNA의 상대적으로 낮은 금액입니다. 그러나,이 제한은 microglia 수로 두뇌 개발 (표 1)의 초기 단계에서 매우 낮은 기술적인 문제 보다는 더 많은 생물 학적 문제입니다. 수집 하는 RNA의이 낮은 양 때문에 증폭 단계 게놈 넓은 유전자 표정 분석을 수행 하기 위해 고려 될 필요가 있다. 다행히도, 이러한 증폭 단계 고품질 cDNA의 충분 한 양을 생산. 따라서, 고립 된 세포의 유전자 식 프로필에 글로벌 변화는 공부 될 수 있다.
결론적으로,이 프로토콜에는 격리 하 고 애벌레 zebrafish 두뇌에서 다양 한 CNS 셀 유형을 공부 강력한 방법을 제공 한다. 이것은 또한 질병에 그들의 역할을 연구로 개발 하는 동안이 세포의 깊은 이해를 얻기 위해 적용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리 초기 도움말 및 실험적인 접근 및 QMRI Flow Cytometry 셀 정렬 시설에 대 한 토론에 대 한 박사 클레어 데이비스와 닥터 베로 Miron (여왕의 의료 연구소, 에든버러, 유나이티드 Kingdome) 감사합니다. 이 작품은 박사 더크 Sieger에 암 연구 영국 경력 설립 수상에 의해 지원 되었다.
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
Hepes | Gibco | 15630-056 | |
D-Glucose | Sigma | G8644-100ML | |
HBSS 1X | Gibco | 14170-088 | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
HBSS 10X | Gibco | 14180-046 | |
DPBS 1X | Gibco | 14190-094 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A5040 | |
Sterilin standard 90mm petri dishes | ThermoFisher | 101VIRR | |
Surgical micro-scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
3 mL Pasteur plastic bulk pipette | SLS | PIP4206 | |
Glass homogenizer | Wheaton | 357538 | |
Sterilin standard 55mm petri dishes | ThermoFisher | P55V | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
50 ml polypropylen conical tube | Falcon | 352070 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
10 mL syringe | BD | 302188 | |
Needle 23G x 1'' | BD | 300800 | |
Normal goat serum (NGS) | Cell Signalling | 5425S | |
35 μm cell strainer cap | BD | 352235 | |
FACS tubes | BD | 352063 | |
Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF) | Biolegend | 101321 | |
Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A11008 | |
Anti-4C4 | Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh) | ||
FACS sorter FACSAria II | BD | QMRI, FACS facility | |
RNeasy Plus Micro Kit | QIAGEN | 74034 | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725271 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080-051 | |
LightCycler 96 Real-Time PCR System | Roche | ||
Ovation RNA-Seq System V2 | NuGEN | 7102-32 | |
Agilent RNA 6000 Pico reagents | Agilent | 5067-1513 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
RNaseZap | Ambion | AM9780 |