Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling
Summary
Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire’s vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.
Abstract
De DNA schade reactie (DDR) maakt gebruik van een overvloed aan eiwitten te detecteren, signaleren en repareren van DNA laesies. Deze reactie uitgezet is cruciaal voor het genoom onderhoud mechanismen begrijpen. Aangezien werving en uitwisseling van eiwitten bij letsels hoogst dynamische zijn, vereist hun studie de capaciteit voor het genereren van DNA-beschadiging in een snelle en ruimtelijk gescheiden wijze. Hier beschrijven we procedures om lokaal de schade van DNA in menselijke cellen met behulp van een algemeen beschikbare laser-scannen confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser lijn. Accumulatie van genoom “onderhoud” factoren op laser strepen kunnen worden beoordeeld door immunofluorescentie (IF) of in real-time met behulp van eiwitten die zijn gelabeld met de fluorescerende verslaggevers. Met behulp van gefosforyleerd Histon H2A. X (γ-H2A.X) en replicatie eiwit A (RPA) als markeringen, de methode biedt voldoende resolutie te discrimineren lokaal aangeworven factoren die verspreid over de aangrenzende chromatine. Wij bieden verder ImageJ gebaseerde scripts aan efficiënt toezicht op de kinetiek van eiwit Herlokalisatie op DNA schade sites. Deze verfijningen vereenvoudigen sterk de studie van de dynamiek van de DDR.
Introduction
Cellen worden voortdurend blootgesteld aan endogene en exogene bronnen van DNA-schade die hun genomic integriteit bedreigen. De DDR is een ensemble van signalering van trajecten die detecteren, signaleren en repareren van DNA laesies te handhaven van de stabiliteit van het genoom. DNA-double-stranded einden (DSBs), de DDR gebeurt voornamelijk op twee complementaire platformen: γ-H2A.X-geëtiketteerden chromatine en een resected single-stranded DNA (ssDNA) regio meestal bekleed met de ssDNA-bindende complexe RPA1,2.
UV-laser-micro-bestraling van cellen vooraf gesensibiliseerde personen met de thymidine analoge 5-bromo-2′ deoxyuridine (BrdU) of de bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA kleurstof wordt gemaakt van een mengsel van DNA letsels, met inbegrip van single-stranded einden ( SSBs) en DSBs die een gelokaliseerde DDR op zowel de ssDNA als de chromatine platformen3,4te ontlokken. Vorige werk bleek dat rekrutering van het genoom onderhoud factoren aan deze twee verschillende platformen op DSB kan worden onderscheiden met behulp van energierijke UV-A lasers (335-365 nm) gecombineerd met als2,5. Microscopen uitgerust met dergelijke lasers zijn kostbaar, aangezien zij vereisen een hoge energie-laser en speciale UV-A-verzendende doelstellingen, waardoor ze veel minder gangbaar in academische en farmaceutische instellingen dan laser-scannen confocal microscopen met 405 nm laser lijnen. De studie van eiwit werving en uitwisseling op micro-bestraalde sites is ook uitgesloten door het moeizame handmatige beeldanalyse moet beschrijven het dynamisch gedrag van genoom onderhoud factoren.
Hier, laten we zien dat de pre sensibilisatie van cellen met BrdU of BBET nucleïnezuur vlek gevolgd door micro-bestraling met behulp van een 405 nm laser op een gemeenschappelijke confocal microscoop kan de bewaking van het genoom onderhoud factor dynamiek DNA laesies. Met behulp van γ-H2A.X of RPA complexe subeenheden als platform markers samen met z-stapelen voor groter scherptediepte en deconvolutie voor verbeterde resolutie kunt de experimentator te discrimineren factoren die lokaal worden gerekruteerd voor DSBs die verspreidde zich naar grote chromatine domeinen rondom de initiële laesie. Deze sub classificatie volgens verschillende intra nucleaire compartimenten helpt de potentiële rol van genfunctieonderzoek eiwitten gerekruteerd om micro-bestraalde sites te verfijnen. Bovendien, wij bieden handige protocollen en geoptimaliseerd pijpleidingen om snel de dynamiek van genoom onderhoud factoren met behulp van de open-sourcesoftware Fiji (een ImageJ distributie)6,7,8te analyseren. Deze verfijningen aan huidige micro-bestraling methoden maken de studie van de DDR mogelijk in vrijwel elke omgeving laboratorium.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven methoden kunt, 405 nm laser-micro-bestraling van vooraf met BBET of BrdU gesensibiliseerde cellen de gelokaliseerde generatie van DNA letsels, met inbegrip van DSBs binnen de kernen van aanhangend menselijke cellen. Kinetiek van de DDR op deze DSBs zijn vergelijkbaar met die worden gegenereerd met andere methoden in eukaryote cellen9,18,19. DSB resectie op micro-bestraalde sites leidt tot ssDNA-generatie …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [Discovery subsidie 5026 A.M] en door een volgende generatie van wetenschappers beurs van de Cancer Research Society [21531 naar A.M]. Wij danken Jean-François Lucier voor het uitstekende kwaliteitscontrole van de Fiji Python scripts en advies verstrekken over statistische analyse. Wij danken Dr. Stephanie A. Yazinski voor de als recept voor de oplossing van de fixatie. We bedanken Paul-Ludovic Karsenti voor hulp met laser macht metingen.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
Referenzen
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
