Un'analisi di Microarray della proteina per determinazione sierologica dell'infezione di Clostridium difficile anticorpo seguenti risposte antigene-specifiche

Questo protocollo descrive lo sviluppo e la convalida di un’analisi di microarray della proteina di romanzo e su misura per il rilevamento e semi-quantificazione del ceppo batterico e le risposte specifiche dell’isotipo dell’anticorpo agli antigeni di c. difficile . Utilizziamo con successo la nostra difficile del c.-analisi di microarray specifici come un promettente nuovo strumento per la bioanalysis compositiva del contenuto di anticorpi specifici nei sieri dei pazienti^1,2, preparazioni di IVIg³, e identificazione delle specificità dell’anticorpo che correlano con i risultati difficili in CDI⁴. Dimostriamo come campioni di siero biobanked e preparazioni commerciali di IVIg possono essere analizzate su diapositive di microarray, che permette alta qualità riproducibile profilatura delle risposte di agente patogeno specifico anticorpo di c. difficile in questo test.

Molti bambini sani e adulti hanno anticorpi IgG e IgA siero rilevabile c. difficile tossine A e B^5,6. Questi sono pensati per risultare a seguito di esposizione transitoria durante l’infanzia e dopo esposizione a c. difficile in età adulta. Per questo motivo, policlonali IVIg è stato utilizzato off-label per il trattamento sia ricorrente e fulminante CDI^7,8,9. Tuttavia, il suo ruolo definitivo e modalità di azione rimane poco chiaro. Parecchi studi hanno indicato che la risposta immunitaria umorale alle tossine di c. difficile svolge un ruolo nella presentazione della malattia e nel risultato. In particolare, i pazienti asintomatici mostrano una concentrazione aumentata del siero anti-tossina A IgG rispetto ai pazienti che sviluppano la malattia sintomatica¹⁰. Un’associazione dimostrabile è stata segnalata per i titoli di IgG A di mediano anti-tossina e mortalità per qualsiasi causa 30 giorni¹¹. Parecchi rapporti hanno rivelato anche un’associazione con una protezione contro le risposte di ricorrenza e l’anticorpo per la tossina A, B e diversi antigeni non-tossina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteine di strato di superficie (SLP))^{12,13 , 14 , 15}. queste osservazioni hanno stimolato lo sviluppo del primo immunoterapia passiva drug targeting c. difficile tossina B (bezlotuxumab), che è stato recentemente approvato dalla US Food and Drug Administration e l’Agenzia europea dei Agenzia per la prevenzione di ricorrenti CDI¹⁶. Strategie vaccinali utilizzando le tossine inattivate o frammenti di tossina ricombinante sono inoltre attualmente in sviluppo^17,18,19. Questi nuovi approcci terapeutici senza dubbio stimolerà il requisito per valutare le risposte immunitarie umorali agli antigeni multipli in campioni di grandi dimensioni.

Oggi, c’è una notevole mancanza di saggi ad alta velocità disponibile in commercio in grado di valutare contemporaneamente il ceppo batterico e le risposte specifiche dell’isotipo dell’anticorpo agli antigeni di c. difficile . C’è un bisogno insoddisfatto per sviluppare tali dosaggi per facilitare gli sforzi di ricerca futura e applicazioni cliniche. Microarrays della proteina sono un metodo per immobilizzare un numero elevato di proteine purificate individualmente come matrice spazialmente organizzata dei punti su una superficie basata su vetrino al microscopio utilizzando un sistema robotico, che può essere un contatto²⁰ o un non-contatto stampa strumento²¹. Le macchie possono rappresentare miscele complesse come lisati cellulari, anticorpi, omogenati, proteine endogene o ricombinante o peptidi, fluidi corporei o farmaci^22,23.

Tecnologia di microarray della proteina offre chiari vantaggi rispetto a standard in-House ELISA tecniche, che sono stati tradizionalmente usati per valutare le risposte di anticorpi di anti –c. difficile . Questi includono una maggiore capacità per la rilevazione di una gamma di multi-specifici anticorpi contro un pannello più ampio di bersagli proteici, requisiti di volume ridotto per gli antigeni, campioni e reagenti e una maggiore capacità di incorporare una più grande numero di repliche tecniche, oltre a controllo di qualità interno multiple (QC) misura¹. I microarrays sono quindi più sensibile, accurato e riproducibile e hanno una maggiore gamma dinamica. Questi fattori rendono i microarrays un’alternativa più conveniente e potenzialmente favorevole a Elisa per la rilevazione su larga scala di proteine note. Tuttavia, gli svantaggi della tecnologia microarray dovuti principalmente i grandi costi iniziali associati che istituisce un pannello di antigeni altamente purificati e la creazione della piattaforma tecnologica.

Microarrays della proteina sono stati ampiamente utilizzati negli ultimi due decenni come strumento di ricerca diagnostica di base in applicazioni cliniche. Applicazioni specifiche includono l’espressione della proteina di profilatura, lo studio delle relazioni di enzima-substrato, lo screening biomarcatore, analisi delle interazioni ospite-microbo e profilatura anticorpo specificità^{23,24, 25,26,27,28}. Molti nuovo agente patogeno/antigene della proteina microarrays sono stati stabiliti, tra cui la malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, riossidazione³¹, sindrome respiratoria acuta grave (SARS)³², febbre emorragica virale³³ , herpesvirus³⁴e³⁵di tubercolosi.

Il presente protocollo si riferisce all’istituzione di un facile funzionamento C. difficile reattiva dosaggio dell’antigene microarray, che consente la quantificazione precisa e specifica di multi-isotipo e le risposte dell’anticorpo specifico ceppo di C. difficile antigeni nel siero e policlonale IVIg. Nel presente documento, includiamo risultati rappresentativi relativi ad una prestazione di analisi di microarray di accettabile rispetto a ELISA così come dosaggio precisione e riproducibilità profili. Questo test potrebbe essere ulteriormente sviluppato per profilare altri campioni clinici e stabilisce un nuovo standard per la ricerca della base molecolare della CDI.