Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een nieuwe en aangepaste eiwit microarray assay voor het opsporen en semi-kwantificering van bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Wij gebruiken met succes onze C. difficile-specifieke microarray assay als een veelbelovend nieuw hulpmiddel voor de compositorische bioanalyse van specifieke antilichaam inhoud in patiënt sera^1,2, bereidingen van IVIg³, en identificatie van specifieke kenmerken van antilichaam die met de slechte resultaten in de CDI^{4 correleren}. We laten zien hoe biobanked serummonsters en commerciële preparaten van IVIg kunnen worden geanalyseerd op microarray dia’s, waardoor hoge kwaliteit reproduceerbaar profilering van C. difficile pathogeen-specifieke antilichaam reacties in deze test.

Veel gezonde kinderen en volwassenen hebben detecteerbare serum IgG- en IgA-antilichamen tegen C. difficile toxines A en B^5,6. Deze worden verondersteld te ontstaan naar aanleiding van voorbijgaande blootstelling tijdens kinderschoenen en na blootstelling aan C. difficile in de volwassenheid. Om deze reden polyklonale IVIg is afwijkend gebruikt voor de behandeling van recidiverende zowel fulminant CDI^7,8,9. Echter, haar definitieve rol en werkingsmechanisme is onduidelijk. Verschillende studies hebben aangetoond dat de humorale immune reactie op toxines van C. difficile een rol bij ziekte presentatie en resultaat speelt. Specifiek, weergeven asymptomatische patiënten een verhoogde anti-toxine A IgG serumconcentratie vergeleken met patiënten die de ontwikkeling van de symptomatische ziekte¹⁰ Een aantoonbare vereniging is gemeld voor de mediane anti-toxine A IgG titers en 30-daagse all-cause mortality¹¹. Verscheidene verslagen is ook gebleken dat een associatie met een bescherming tegen herhaling en antilichaam reacties op het toxine A, B en verschillende niet-toxine antigenen (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD en toplaag eiwitten (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. deze opmerkingen hebben aangespoord de ontwikkeling van de eerste passieve immunotherapie drug-toxine met targeting C. difficile B (bezlotuxumab), dat onlangs is goedgekeurd door de US Food and Drug Administration en het Europees Geneesmiddelenbureau Agentschap voor het voorkomen van terugkerende CDI¹⁶. Vaccinatiestrategieën door middel van geïnactiveerd toxines of recombinante toxine fragmenten zijn ook momenteel in ontwikkeling^17,18,19. Deze nieuwe therapeutische benaderingen zullen ongetwijfeld het stimuleren van de eis voor de evaluatie van de humorale immuunreacties aan meerdere antigenen in grote steekproeven.

Vandaag, is er een opmerkelijke gebrek verkrijgbare high-throughput assays staat gelijktijdig bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Er is een unmet behoefte aan het ontwikkelen van deze gehaltebepalingen om toekomstige onderzoeksinspanningen en klinische toepassingen te vergemakkelijken. Eiwit microarrays is een methode om grote aantallen van individueel gezuiverd eiwitten als een ruimtelijk georganiseerde matrix van plekken op een microscopische dia gebaseerde oppervlak te immobiliseren met behulp van een robot systeem, dat een contact²⁰ of een contactloze zijn kan gereedschap²¹afdrukken. De plekken kunnen complexe mengsels zoals cel lysates, antilichamen, weefsel homogenates, endogene of recombinante eiwitten peptiden, lichaamsvloeistoffen of drugs^22,23vertegenwoordigen.

Eiwit microarray technologie biedt duidelijke voordelen boven standaard in-house ELISA technieken, die van oudsher gebruikt hebben om te beoordelen van de anti –C. difficile antilichaam reacties. Deze omvatten een grotere capaciteit voor het opsporen van een aantal multi-isotype-specifieke antistoffen tegen een uitgebreidere panel van eiwit doelen, verminderde volume eisen voor antigenen, monsters en reagentia, en een verbeterde mogelijkheid om te integreren in een groter aantal technische replicatieonderzoeken, naast meerdere interne kwaliteitscontrole (QC) meet¹. Microarrays zijn daarom meer gevoelige, nauwkeurig en reproduceerbaar en hebben een groter dynamisch bereik. Deze factoren maken microarrays een goedkoper en potentieel gunstige alternatief voor ELISAs voor de grootschalige opsporing van bekende eiwitten. Nadelen van microarray technologie leidt echter tot voornamelijk uit de grote up-front kosten in verband met de oprichting van een panel van hoogst gezuiverde antigenen en het opzetten van het technologische platform.

Eiwit microarrays zijn uitgebreid gebruikt in de afgelopen twee decennia als een onderzoeksinstrument van de diagnostische en fundamenteel in klinische toepassingen. Specifieke toepassingen omvatten eiwit expressie profilering, de studie van enzym-substraat relaties, biomerker screening, analyse van host-microbe interacties, en profiling van antilichaam specificiteit^{23,24, 25,26,27,28}. Veel nieuwe pathogen eiwit/antigeen microarrays zijn vastgesteld, met inbegrip van malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, influenza³¹, ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS)³², virale hemorragische koorts³³ , infectieziekte³⁴en³⁵van de tuberculose.

Dit protocol heeft betrekking op de oprichting van een eenvoudige operationele C. difficile reactieve antigeen microarray assay, waarmee specifieke, nauwkeurige en precieze kwantificering van multi-isotype en stam-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen in sera en polyclonal IVIg. Wij zijn hierin, representatieve resultaten met betrekking tot een aanvaardbaar microarray assay prestaties in vergelijking met ELISA evenals assay nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de techniek van profielen. Deze bepaling verder kan worden ontwikkeld om het profiel van andere klinische monsters en zet een nieuwe standaard voor onderzoek naar de moleculaire basis van de CDI.