微电极阵列技术在完整仔猪脑麻醉诱导神经毒性研究中的应用
Summary
本研究探讨了用酶基微电极阵列技术监测仔猪体内的活体神经递质活性的新方法.假设谷氨酸失调有助于麻醉神经毒性的机制。在此, 我们提出了一种适应多边环境技术的协议, 研究麻醉诱发神经毒性的机制。
Abstract
每年都有数以百万计的儿童接受麻醉以进行多种手术。然而, 在动物和人类的研究中, 对儿童麻醉的安全性提出质疑, 将麻醉药作为发展中大脑的潜在毒性。迄今为止, 没有研究成功地阐明了麻醉可能是神经毒性的机制。动物研究允许对这种机制进行调查, 而新生仔猪则是研究这些效应的优良模型, 因为它们与人脑的发育相似性显著。
该协议采用酶基微电极阵列技术作为研究麻醉诱发神经毒性机制的新方法。多边环境协定允许对体内神经递质活动进行实时监测, 并提供异常的时间和空间分辨率。假设麻醉神经毒性是由谷氨酸失调部分引起的, 而多边环境协定则提供一种测定谷氨酸的方法。该技术在仔猪模型中的新实现, 为研究这一问题提供了一个独特的机会。
Introduction
每年, 数以百万计的儿童在美国的1个侵入性和非侵入性程序中都接受麻醉。多年来, 麻醉提供者已经向父母们保证了麻醉药的安全性, 即使是在小孩和新生儿中也是如此。然而, 在1999年发现, 在早期的生命中, n-甲基-d-天门冬氨酸受体亚型的瞬态阻断可能会导致大鼠的神经细胞凋亡2。最近, FDA 发布了一项药物安全通讯, 要求麻醉药品的标签包括对一般麻醉药的警告, 以及它们对3岁以下儿童发育大脑的潜在负面影响 (美国食品和药物管理局, 2017)。然而, 仍然需要阐明可能的机制和潜在的保护措施。
谷氨酸和伽玛氨基丁酸 (GABA) 等神经递质的正常活动对正常神经发育的发生至关重要。虽然大部分涉及的路径仍然是难以捉摸的, 神经递质系统很可能会参与, 因为麻醉剂是已知的调节这些途径, 以产生无意识。特别是, 兴奋性神经递质谷氨酸导致兴奋时, 其活动失调。这种神经递质通常涉及神经发生、神经系统可塑性、突触和神经生长, 以及其他一些重要的脑功能。然而, 长期活化谷氨酸受体可能导致兴奋和神经细胞凋亡, 特别是在压力条件下, 如手术, 缺氧, 减少能源可用性3。谷氨酸与 NMDA 受体的结合已被证明导致 Na+和 Cl−流入。随后的退极化被认为导致 ca2 +通道打开和释放胞内 Ca2 +存储4。这种功能障碍可能导致一连串的代谢紊乱, 最终减少神经细胞的增殖, 增加炎症, 并导致神经元死亡。尽管有这些假设, 但实际机制仍不清楚5。谷氨酸失调由于其在细胞凋亡中的作用, 它代表了一种新的途径, 它可能有助于以前记录的神经元凋亡机制, 这是一种重要的特征。
神经过程研究的障碍之一是它们的高度复杂性, 特别是在神经元发育的设置中。最初几个月的生命是最容易受伤的时期, 在这期间, 神经发育的重要步骤, 如生理凋亡 (神经修剪), synaptogenesis, gliogenesis 和髓鞘形成发生6.鉴于神经元通信的复杂性以及在不破坏正常中枢神经功能的情况下研究这些过程的困难, 已经开发出了针对体内检测和量化重要元素的新技术。神经元通讯。
本研究采用酶联的多边环境技术, 作为研究仔猪模型中的作用机理的一种新方法。该技术可用于研究复杂的体内电化学脑过程, 包括谷氨酸失调。纳入多边环境协定的4通道白金记录站点 (2 个谷氨酸敏感的站点和2个定点站点) 允许自我引用, 这有助于检测的准确性。此外, 将排除层应用于每个电极, 通过防止其他干扰分子检测到7来赋予选择性。此外, 与早期技术相比, 该多边环境协定的低调设计使组织创伤最小。这一特性赋予了更高的空间分辨率, 有利于研究大脑中的微观区域。例如, 海马体 (齿状回、CA1、CA2) 的离散区域可以专门研究8。关于多边环境协定的功能的具体细节以前已被描述为9。
与电化学技术相比, 微透析结合了在兴趣溶液和类似成分溶液之间放置的膜, 允许检测胞外流体变化10。虽然微透析是神经系统的重要支柱, 长期以来一直用于神经递质的检测, 但它具有低时间分辨、谷氨酸变化延迟检测和重大组织损伤的缺点11。
多边环境协定可以间接检测神经递质, 如谷氨酸, 乙酰胆碱, 胆碱, 通过使用适当的氧化酶, 产生活性记者分子, 如 H2O2或 O212,13.
多边环境协定技术已被广泛应用于大鼠和非人类灵长类动物, 用于研究病理生理学过程中的神经毒性, 而不是7,14。在其中一些病理生理学过程中, 多边环境协定技术已被用于研究阿尔茨海默病、癫痫、外伤性脑损伤, 以及药理作用对突触通讯的影响8,15,16,17. 尽管多边环境协定已被用于研究大鼠和非人类灵长类动物的这些病态, 但人类与仔猪大脑的高度发展相似性使得对仔猪的气候变化技术的适应成为一种非常适宜的研究方法。(s) 机制18。
Protocol
Representative Results
Discussion
从实验开始, 小猪的生理动态平衡必须按照本实验室先前发布的21中的描述进行维护。最小的监测应包括脉冲氧, 心电图, capnography, 无创血压和温度。需要训练有素的调查人员, 以便能够适当纠正生理扰动 (例如, 如、低体温/热疗、缺氧、低血压、心律失常)。
在归纳之前,体外在已知条件下进行校准, 以建立多边环境协定的功能和选择性。多边环境协定的校准和电镀是有效利用该技术的关键。在校准过程中可能会出现许多可能的错误。校准可以识别这些问题以及不正确的电镀, 导致错误的干扰响应。编写了一个更详细的表格, 说明了在多边环境协定响应中可能发生的错误, 以及值得注意的原因和建议的解决方案, 这些都应该成为可能的疑难解答的有用工具 (表 1)。必须注意的是, 在校准和电镀之前, 应检查玻璃参考电极是否存在气泡或白色变色, 因为两者都将消极地影响多边环境协定的功能和记录的准确性。
| 症状 | 原因 | 纠正措施 |
| 无信号 | 电极未连接 | 正确地将电极连接到 headstage 和 headstage, 以快速探头系统。 |
| 对快速探头系统没有动力 | 打开快速系统背面的电源开关 | |
| 信号噪声 | 被血液污染的电极 | 在电极插入过程中持续冲洗脑表面 |
| 立即在 dH2O 中漂洗电极 | ||
| 酶膜松动 | 清洁和 recoat 电极 | |
| 未插入或涂覆参考电极 | 外套和放置参考电极更远的头皮下 | |
| 电极检测脑表面运动 | 通常发生在浅层结构中。如果可能, 将电极深度插入 (一次1毫米) | |
| 动物运动 | 动物没有得到充分的保护 | 移动后方向的动物, 以更好地安全 earbars 的头骨。如有必要, 提升躯干, 使身体更好地对准。 |
| 动物麻醉不充分 | 验证麻醉设备的完整性。滴定麻醉的有效剂量和管理肌内的罗库溴铵剂量 (5 毫克/千克) | |
| 电极放置不准确 | 电极未正确对齐 | 调整电极, 同时保持与 headstage 的正确连接。 |
| 立体定向坐标不准确 | 确保所引用的小猪图谱不使用另一个参照点或对齐平面。 | |
| 小心不要通过评分头骨来掩盖缝合痕迹。 |
表 1: 在仔猪中使用的疑难解答说明.可能的原因和纠正措施, 以协助优化和故障排除。
一个用于小猪的立体定向图谱用于确定感兴趣区域的立体定位坐标, 例如 bregma18。应妥善保护耳棒, 以确保头骨水平和完全固定。应注意在头皮中线切口, 以避免评分的头骨, 因为这可能会影响可视化缝合线。开颅窗应大到足以容纳多边环境协定。
该议定书提出了一些技术挑战, 需要有一个库存充足的操作套件和一个熟练掌握该议定书的外科和麻醉方面的调查员/小组。该模型还提出了财政限制, 因为小猪模型比啮齿动物模型更昂贵;然而, 它的成本大大低于使用非人类灵长类动物, 这可以花费上千美元。使用多边环境协定技术提出了自己的挑战, 因为手工涂敷和电镀电极的过程需要熟练的调查员或助理, 以确保足够的选择性和可靠的功能。电极本身是脆弱的, 因为它们是由陶瓷制成的, 因此如果没有观察到适当的谨慎, 就容易损坏。电极受到来自其他电气设备的干扰, 这些装置可以在录音中制造噪音, 并可在操作现场的血液中产生噪声, 咬合记录地点。需要专用设备带来额外的负担, 因为立体定向手术框架必须是定制的, 以固定的小猪头骨在植入过程中。立体定向的框架, 谷氨酸氧化酶, 和电极本身都是昂贵的。此外, 在过去十年中缺乏一只小猪立体定位图谱, 造成技术上的限制, 需要特定的专门知识来确定小猪大脑深层结构的具体位置。开发一个新的立体定向图谱, 也许使用磁共振成像, 将大大提高在仔猪中使用这种技术的能力。
仔猪是一种临床上相关的模型, 主要是由于这一物种和人类新生儿之间存在的相似性, 因为两者都具有相似的大脑结构和发展。与更常用的模型, 如老鼠或老鼠, 小猪有一个更大的中枢神经系统的相似性与人类, 这借给了模型的结果可译性。小猪模型是另外便宜和涉及较少复杂处理比非人类灵长类动物模型。小猪模型旨在研究麻醉可能诱发发育性神经毒性的过程, 测量其对神经损伤的贡献, 并与混淆变量引起的损害问题作斗争。例如, 缺氧可能被误解为麻醉剂造成的损害, 因为它对大脑有全球性的影响。仔猪的使用与人类医学中使用的外科和麻醉条件相同, 以确保结果的逼真度。
用陶瓷为基础的多边环境技术消除了与现代微透析技术相关的一些缺点。微透析与诸如多边环境协定等安培方法相比, 具有有限的时间和空间分辨率, 可以在多达10赫兹23的多个微观区域连续记录谷氨酸事件。这种快速采样率消除了局部神经递质扩散的混杂因子, 这是慢采样方法 (如微透析24) 所固有的。此外, 多边环境协定是一种比微透析探针更少的侵入性方法, 在插入的过程中可能导致显著的胶质, 并且可以改变插入点22的神经递质活动。
以前的研究使用了一系列哺乳动物模型, 测量技术和大脑区域, 表明了基本的谷氨酸水平, 可与使用这种技术发现。这表明, 在适应仔猪模型时, 多边环境协定技术提供了对体内谷氨酸浓度 (表 2) 的有效记录。
| 作者 (年) | 录音技术 | 动物模型 | 年龄 | 脑区 (s) | 平均基底谷氨酸浓度 (µM) |
| Hascup 等 (2008)23 | (以酶为基础) | 啮齿动物 | 20-24 周 | 前额叶皮质, 纹状体 | 3.3 ~ 1.0;5.0 @ 1。2 |
| Hascup 等 (2010)25 | (以酶为基础) | 啮齿动物 | 3-6 月 | 海马 | 4.7-10。4 |
| 卢瑟福等 (2007)9 | (以酶为基础) | 啮齿动物 | 3-6 月 | 前额叶皮质, 纹状体 | 44.9 ~ 4.7;7.3 @ 0。9 |
| Miele 等 (1996)26 | 微透析 (酶基) | 啮齿动物 | – | 纹 状 体 | 3.6 @ 0。5 |
| 日 et 等 (2006)27 | (以酶为基础) | 啮齿动物 | 3-6 月 | 额叶皮层, 纹状体 | 1.6 @ 0.3; 1.4 @ 0。2 |
| 金特罗·库维德斯等 (2007)28 | (以酶为基础) | 非人类灵长类动物 | 5.3-5.5 年 | 前运动神经皮质, 运动皮层 | 3.8 ~ 1.7;3.7 @ 0。9 |
| 斯蒂芬斯等。 (2010)29 | 协定 [Spencer-Gerhardt-2 (SG-2)] | 非人类灵长类动物 | 11-21 年 | 壳 | 8.53 |
| Kodama 等 (2002)30 | 微透析 (酶基) | 非人类灵长类动物 | – | 前额叶皮质 | 1.29-2.21 |
| 盖文等 (2003)31 | 微透析 (酶基) | 非人类灵长类动物 | 青少年 | 纹 状 体 | 28.74 @ 2.73 |
| 期间和斯宾塞 (1993)32 | 微透析 (酶基) | 人类 | 18-35 年 | 海马 | 20.3 @ 6。6 |
| Reinstrup 等 (2000)33 | 微透析 (酶基) | 人类 | – | 额叶皮质 | 16 @ 16 |
| Cavus 等 (2005)34 | 微透析 (酶基) | 人类 | 15-52 年 | 大脑皮层 | 2.6 @ 0。3 |
表2。不同动物模型基底胞外谷氨酸 levelsacross 的比较。对在健康清醒和麻醉动物中使用微透析或电极建立正常胞外谷氨酸水平的研究进行的选择性审查。
使用多边环境协定技术来监测仔猪模型中的体内谷氨酸浓度, 可以使今后对仔猪神经功能的评估成为麻醉后的结果。已经计划了生存实验, 这将进一步了解麻醉对人类新生儿认知幸福的长期影响。生存实验将允许在麻醉暴露后长时间进行行为测试和谷氨酸变化监测。儿童在有可能以手术干预的形式经历生理压力的情况下接受麻醉也很常见。未来的研究, 以解决的影响, 手术的神经损伤和增加神经毒性将允许更准确的模拟一个共同的临床设置为儿童。使用替代动物模型也是可行的, 这也是通过慢性植入对这些模型进行研究, 使我们能够追踪与神经毒性相关的行为变化。技术本身是多才多艺的, 所以未来的研究不需要局限于谷氨酸水平的分析 (例如, GABA, 胆碱, 赖氨酸,等).可以分析)。
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢肯塔基大学微电极技术中心 (CenMeT) 和俄亥俄州立大学实验动物资源中心 (乌拉尔) 的贡献。
Materials
| Advance Liqui-Wean Pig Milk Replacer | PBS Animal Health | 292-13 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Sevoflurane | Ultane | 0074-4456-04 | |
| Rocuronium Bromide Injection | Hospira | 0409-9558-05 | |
| Medfusion 4000 IV Infusion | Smiths Medical | ||
| Model 1530 Heavy-Duty Research Model Stereotax | Kopf | custom made | |
| Model 1541 Piglet Adaptor | Kopf | custom made | |
| Infrared Spot Lamp | Amazon | B000HHQ94C | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Fisherbrand | 22-363-750 | |
| Carbon Steel Rib-Back Surgical Blade | Bard-Parker | #10 | |
| Scalpel Handel | Havel's | HAN-G4 | |
| Surgical Scissors | World Precision Instruments | 504615 | |
| Mosquito Forceps | Sklar Surgical Instruments | 17-1225 | |
| Gauze Pads | Fisherbrand | 22-246-069 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| Dremel 111 Engraving Cutter | Amazon | Dremel 111 | |
| Microelectrode Array | Center for Microelectrdoe Technology, University of Kentucky | S2 4Ch MEA; custom made | |
| Headstage | Quanteon | 2pA/mV | |
| Wire, silver, PFA, .008" Bare, .0110" coated | A-M Systems | 786500 | |
| Fine Micromanipulator | Narishige Scientific Instrument Lab | MO-8 |
Referenzen
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