Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

O protocolo de estudo foi aprovado pela institucional Review Board do National Cancer Center, Coreia (NCCNCS-12-630). 1. amostra preparação (30 min) Para a cultura de células HeLa (CCL-2, ATCC), use meio DMEM completo 10 mL (10% de soro fetal bovino, 1% caneta-estreptococo) em uma placa de cultura de 100 mm. Para preparar o soro de fome as células HeLa, incube HeLa confluentes em DMEM sem soro fetal bovino por 48 horas, conforme descrito em um anterior de estudo11. Para desprender as células, lave-os com 2 mL fosfato salino (PBS) e adicione a tripsina de EDTA de 0,25% de 2 mL por placa de cultura de 100 mm. Em seguida, incubar durante 2-3 min numa incubadora de CO2 a 37 ° C. Adicionar 5 mL de meio DMEM completo para o prato de cultura para desactivar a tripsina e transfira as células destacadas para um tubo de 15 mL. Em seguida, Centrifugar as células a 300 x g durante 10 minutos formar um pellet. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com PBS frio 2 mL por centrifugação a 300 x g durante 10 minutos. Após a remoção do líquido sobrenadante, adicionar 1 mL de etanol a 95% para o centrifugado e misture o centrifugado com etanol vortexing. Manter as células fixas no gelo até a preparação do bloco de celas. 2. bloco de celas-preparação (1 h 30 min) Para a preparação de plasma congelado alíquotas, coleta de plasma EDTA de sangue de doadores saudáveis centrifugar 13.000 x g por 10 min. coletar o plasma sobrenadante e tubos de alíquota 200-400 µ l cada em microcentrífuga. Armazene as alíquotas a-80 ° C até o uso. Quando as alíquotas de plasma congelado estão prontas, recuperá-los e descongelar o plasma por incubação a 37 ° C por 5 min. Centrifugar as células fixas em 700 x g durante 10 minutos e, em seguida, descartar o sobrenadante. Misture o centrifugado com 2 gotas (cerca de 200 µ l) do plasma, 2 gotas de tromboplastina e 2 gotas de cloreto de cálcio 0,025 M. Em seguida, misturá-los por pipetagem. Deixe a mistura formar um coágulo de célula em temperatura ambiente por 10 min, conforme mostrado na Figura 2A. Em seguida, lave o coágulo de célula com PBS duas vezes derramando e removendo PBS com uma pipeta. O coágulo representativas de células brancas é mostrado na Figura 2B. Umedeça um pedaço de papel de filtro com formalina e enrole o coágulo de célula com o papel de filtro úmido. Em seguida, coloque a mistura coagulada com um pincette em uma fita de tecido, como mostrado na Figura 2. Lugar a fita de tecido em um frasco de vidro contendo 50 mL de formalina tamponada (formol a 10% em PBS) durante a noite a 4 ° C para a fixação de formol. 3. tecido processamento e incorporação de parafina (Overnight) Carregar a fita de tecido que contém o coágulo célula fixada em formol em um processador de tecido durante a noite, conforme descrito anteriormente,11. O processamento do tecido é para remoção de água e condicionamento de células fixas à incorporação de parafina. Para pesquisa sem processamento de tecido, execute o tecido procedimento de processamento, como mostrado na tabela 1. Ative a verificação estação e 60 minutos depois, incorporação aquecida é parafina derretida no molde metal nele (Figura 2D). Retirar o coágulo formado célula a fita de tecido e coloque-o na parafina derretida dentro do molde de metal. Lugar a nova fita de tecido sem a tampa para o molde de metal que contém a célula coagular no meio a parafina derretida e despeje mais parafina derretida dentro do estojo de tecido e o molde de metal. Então, deixe a parafina solidificar na placa fria por 30-60 segundos. Separe o molde de metal, a fita de tecido. Em seguida, o bloco de parafina está pronto para imunocitoquímica. O coágulo celular incorporado no bloco de celas de parafina é indicado pela seta na Figura 2E. 4. preparação de Slides para imunocitoquímica (1 h) Verificar a área para o coágulo de célula no bloco de celas de parafina e corte o bloco de celas em fatias com espessuras de 3-4 µm usando um micrótomo. Colocar as secções de parafina em lâminas de vidro revestido-silano, como mostrado na Figura 2F. Coloque as lâminas de seção em um forno de 37 ° C por 30 min fazer as seções aderir para os slides. 5. imunocitoquímica de celas (6 h) Nota: Para immunocytochemical manchas nas seções do bloco de celas, vários kits podem ser usados (ver Tabela de materiais). Todos esses kits tem várias sensibilidades e especificidades dependendo de suas modificações. Incube as seções em 50 mL de xileno para 4 min para eliminação paraffinize. Incube em etanol 100% por 2 min para a desidratação e duas vezes em etanol a 95% e em 80% de etanol por 2 min. Em seguida, remova o etanol em água corrente por 10 min. Para recuperação do antígeno, coloque os slides em um frasco contendo 40 mL Tris-EDTA recuperação buffer, pH 9.0 e ferver em uma panela por 30 min. Lavar as lâminas em água corrente e incube-os em etanol a 95% durante 10 minutos a 4 ° C. Em seguida, marque a área de Coloracao Celular sobre os slides com uma caneta de Pap para fácil identificação. Lavar as lâminas em solução salina tampão Tris contendo 0,2% Tween 20 (TBS-T) e incube no bloco de peróxido de hidrogênio (ver Tabela de materiais) à temperatura ambiente por 15 min remover qualquer atividade de peroxidase remanescente. Em seguida, lave os slides na TBS-T 3 vezes por 2 min cada. Preparar a solução diluída de anticorpo diluindo o anticorpo primário no bloco de proteína (ver Tabela de materiais). Por exemplo, o CKAP2 anticorpo primário pode ser diluído 1: 100 e a 1: 500 do anticorpo de Ki-67. Em seguida, a incubar em 100 µ l de solução diluída de anticorpo por 1h. Após a lavagem TBS-t cinco vezes por 2 min cada, a incubar no realçador de anticorpo primário no kit para 15 min à temperatura ambiente no escuro. Após a lavagem TBS-t, quatro vezes por 2 min cada, adicione 2 gotas de polímero HRP (um anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano silvestre) e a incubar à temperatura ambiente por 30 min. Após a lavagem TBS-t cinco vezes por 2 min cada, adicionar 100 µ l de solução de diaminobenzidina (DAB) (ver Tabela de materiais) e a incubar por 3 min. Após a lavagem TBS-t duas vezes, adicionar 100 µ l de solução de hematoxilina (a mistura de 100 µ l de hematoxilina e 600 µ l de água destilada) e a incubar durante 1 min. Depois de lavar as lâminas em TBS-T uma vez, desidrata-se por incubando em etanol a 95% por 2 min, mergulhando em etanol a 95%, uma vez e mergulhando em etanol 100% duas vezes. Em seguida, a incubar em xilol 40 mL num frasco de vidro por 5 min. Quando os slides estiverem secos de xileno, monte as respectivas lamelas. Observe os padrões de coloração usando microscopia de luz.