Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 국립 암 센터, 한국 (NCCNCS-12-630)에 의해 승인 되었다. 1. 샘플 준비 (30 분) HeLa 세포 (CCL 2, ATCC)의 문화에 대 한 100 m m 문화 접시에 10 mL 전체 DMEM 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 펜-strep)를 사용 합니다. 혈 청에 굶주린 HeLa 세포를 준비 하려면 품 어 소 태아 혈 청 하지 않고 DMEM에 confluent HeLa 세포 48 시간에 대 한 이전 연구11에 설명 된 대로. 세포를 분리 하려면 2 mL 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 함께 그들을 씻어 하 고 100 m m 문화 접시 당 0.25 TA 트립 신 2 mL를 추가 합니다. 그런 다음 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 2-3 분 동안 품 어 트립 신, 비활성화 문화 접시에 완전 한 DMEM 매체의 5 mL을 추가 하 고 15 mL 튜브를 분리 된 세포를 전송. 그런 다음에 펠 릿을 형성 하기 위하여 10 분에 대 한 300 x g에서 셀 원심. 상쾌한, 제거 하 고 10 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 두 번 2 mL 차가운 PBS 가진 펠 릿을 세척. 상쾌한의 제거 후, 셀 펠 릿을 95% 에탄올의 1 mL을 추가 하 고 vortexing에 의해 셀 펠 릿 에탄올과 혼합 합니다. 셀 블록 준비까지 얼음에 고정된 셀을 계속. 2. 셀 블록 준비 (1 시간 30 분) 냉동된 플라즈마의 준비에 대 한 aliquots, 건강 한 기증자 혈액에서 EDTA 플라즈마를 수집 하 고 표면에 뜨는 플라즈마를 수집 하는 13000 x g에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 약 200-400 수 µ L 각에 microfuge 관. 사용까지-80 ° C에서 aliquots를 저장 합니다. 냉동된 플라즈마 aliquots 준비가 되 면, 그들을 검색 하 고 5 분 동안 37 ° C에 외피에 의해 플라즈마를 녹여. 10 분 동안 700 x g에 고정 된 세포를 원심 다음 삭제는 상쾌한. 플라즈마, thromboplastin, 2 방울 및 0.025 M 염화 칼슘 2 방울 2 방울 (약 200 µ L) 셀 펠 릿 믹스. 그런 다음 pipetting으로 그들을 믹스. 그림 2A와 같이 10 분 동안 실내 온도에 셀 응고를 형성 하기 위하여 혼합물을 허용 한다. 그런 다음 세척 PBS와 셀 응고 두 번 붓는 피 펫으로 PBS를 제거 하 여. 대표적인 화이트 셀 응고는 그림 2B에 표시 됩니다. 포 르 말린와 필터 종이 축 축 하 게을 미리 moistened 필터 종이 셀 응고를 포장. 그런 다음 그림 2C와 같이 조직 카세트에는 pincette와 응고 혼합물을 놓습니다. 포 르 말린 고정을 위한 4 ° C에서 하룻밤 버퍼링 된 포 르 말린 (10% 포 르 말린 PBS에) 50 mL를 포함 하는 유리 항아리에 조직 카세트 장소. 3. 조직 처리 및 파라핀 포함 (하룻밤) 포함 하는 포 르 말린 고정 셀 응고 조직 카세트 로드 조직 프로세서에서 앞에서 설명한11하룻밤. 조직 처리 물 제거 및 파라핀 포함 이전에 고정 된 세포의 조절입니다. 조직 처리 없이 연구를 위한 조직 표 1에 표시 된 것 처럼 절차를 처리를 수행 합니다. (그림 2D) 온수 포함 역, 및 60 분 후, 검사는 녹은 파라핀 금속 금형에 거기에 설정. 조직 카세트에서 형성된 된 셀 응고 하 고 금속 금형 내에서 녹은 파라핀에. 장소는 셀을 포함 하는 금속 금형에 뚜껑 없이 새로운 조직 카세트 녹은 파라핀 중간 응고와 조직 카세트에 그리고 금속 금형에 더 많은 녹은 파라핀을 부 어. 그런 다음 30-60 초에 대 한 차가운 접시에 공고히 파라핀 하자. 금속 금형에서 조직 카세트를 분리 합니다. 그런 다음 파라핀 셀 블록은 immunocytochemistry에 대 한 준비. 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 포함 된 셀 응고 그림 2E에서 화살표로 표시 됩니다. 4. Immunocytochemistry (1 시간)에 대 한 슬라이드의 준비 파라핀 셀 블록에 셀 응고에 대 한 영역을 확인 하 고는 톰을 사용 하 여 3-4 µ m의 두께와 조각으로 셀 블록을 잘라. 그림 2 층에서 보는 바와 같이 실 란 코팅 된 유리 슬라이드에 파라핀 섹션을 넣어. 슬라이드에 고착 하는 섹션을 30 분 동안 37 ° C 오븐에 섹션 슬라이드를 놓습니다. 5. 셀 블록 (6 h) Immunocytochemistry 참고: immunocytochemical 셀 블록 섹션에 얼룩, 다양 한 키트 사용할 수 있습니다 ( 재료의 표참조). 이러한 키트는 다양 한 감도 특이성 그들의 수정에 따라 있다. 크 실 렌 드 paraffinize 4 분의 50 mL에 섹션을 품 어. 100% 에탄올 탈수에 대 일 분에 두 번 95% 에탄올, 및 2 분 80% 에탄올에 슬라이드를 품 어. 그런 다음, 실행 10 분 동안 물에 에탄올을 제거 합니다. 항 원 복구에 대 한 병 포함 40 mL 트리 스-EDTA 검색 버퍼, pH 9.0, 슬라이드를 놓고 30 분 동안 솥에 삶아. 실행 물, 아래 슬라이드를 세척 하 고 95% 에탄올 4 ° c.에서 10 분 동안에 그들을 품 어 다음, 슬라이드에 세포 얼룩 지역 Pap 펜 쉽게 식별을 표시 합니다. Tris 버퍼 식 염 수 0.2%를 포함 하는 슬라이드 워시 트윈 20 (TBS-T), 그리고 과산화 수소 블록에서 품 어 ( 재료의 표참조) 모든 나머지 과산화 효소 활동을 제거 하려면 15 분 동안 실내 온도에. 그런 다음 2 분에 대 한 세 번 TBS T에 슬라이드를 씻어. 1 차적인 항 체 단백질 블록에서을 diluting 하 여 희석된 항 체 솔루션을 준비 ( 재료의 표참조). 예를 들어 기본 항 체 수 CKAP2 희석 배율을 사용, 그리고 기-67 항 체 1: 500. 다음, 1 시간에 대 한 항 체 희석된 솔루션의 100 µ L에서 슬라이드를 품 어. 5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 어둠 속에서 실 온에서 15 분 동안 키트에 기본 항 체 증강에 슬라이드를 품 어. 4 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척 후 HRP 폴리머 (이차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소와 함께 표시)의 2 방울을 추가 하 고 30 분 동안 실내 온도에 슬라이드를 품 어. 5 시간 2 분을 위한 TBS T에서 세척, 후 추가 diaminobenzidine (DAB) 솔루션의 100 µ L ( 재료의 표참조), 그리고 3 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 씻은 후 TBS T에 두 번, 되며 솔루션 (100 µ L 되며의와 600 µ L의 증류수의 혼합물), 100 µ L을 추가 하 고 1 분에 대 한 슬라이드를 품 어. TBS-T에서 슬라이드를 한 번 세척 후 2 분에 대 한 95% 에탄올에 잠복기, 95% 에탄올에 담그고 한 번, 그리고 두 번 100% 에탄올에 담그고 탈수. 그런 다음 5 분 동안 유리 항아리 자일 렌 40 mL에에서 슬라이드를 품 어. 슬라이드는 크 실 렌에서 건조, 각 coverslips를 탑재 합니다. 가벼운 현미경 검사 법을 사용 하 여 얼룩 패턴을 관찰 합니다.