Construção do fago sintética exibida Fab biblioteca com diversidade sob medida
Summary
Este protocolo descreve um procedimento detalhado para a construção de uma biblioteca de anticorpo sintético do fago-exibido com diversidade sob medida. Anticorpos sintéticos têm aplicações amplas de pesquisa básica para o diagnóstico da doença e terapêutica.
Abstract
Demanda por anticorpos monoclonais (mAbs) em pesquisa básica e a medicina está a aumentar anualmente. Tecnologia de hibridomas tem sido o método dominante para o desenvolvimento do mAb desde o seu primeiro relatório em 1975. Como uma tecnologia alternativa, métodos de exibição do fago para desenvolvimento do mAb estão cada vez mais atraentes desde que Humira, o primeiro anticorpo derivados do fago e um dos mAbs seller, foi aprovado para o tratamento clínico da artrite reumatoide em 2002. Como um não-animal com base em tecnologia de desenvolvimento do mAb, exposição do fago ignora imunogenicidade do antígeno, humanização e manutenção de animais que são necessárias de desenvolvimento de anticorpo do hybridoma tradicional tecnologia baseada. Neste protocolo, descrevemos um método para construção de sintético do fago-exibido Fab bibliotecas com diversidades de 109-1010 obtenível com uma única eletroporação. Este protocolo é composto por: 1) preparação de alta eficiência de célula electro-competente; 2) extração de uracil contendo ADN single-stranded (dU-ssDNA); 3) método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do oligonucleotide; 4) electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca; 5) ensaio da proteína/L base imunoenzimático (ELISA) para dobrar e avaliação de diversidade funcional; e 6) análise de sequências de ADN da diversidade.
Introduction
Celia tem amplas aplicações variando de pesquisa básica para o diagnóstico de doença e terapêutica. A partir de 2016, mais de 60 mAbs foram aprovados pelos Estados Unidos, Food and Drug Administration (USFDA) para tratamento clínico de doenças auto-imunes, câncer e doenças infecciosas1,2.
Em 1975, Kohler e Milstein relataram uma técnica para a geração contínua de anticorpos de uma única especificidade clonal de uma fonte de celular, conhecida como ‘hibridomas’ e esta técnica posteriormente tornou-se uma pedra angular na medicina e na indústria3 ,4. Geração de mAbs por esse método requer várias etapas, incluindo a produção de antígeno, imunização de rato, extração dos linfócitos B, fusão de células B com células de mieloma para formar células de hibridoma imortal, seleção de clone e para aplicações terapêuticas, humanização é necessário para evitar o anticorpo de humano anti-rato (HAMA)4,5. No entanto, para esta tecnologia, antígenos incluindo proteínas altamente conservadas, patógenos e toxinas são relativamente ineficazes em desencadear uma resposta imune na vivo por mAb produção5.
Em 1978, Hutchison et al relataram o uso do oligonucleotide para mutagénese direto de um resíduo em um single-stranded bacteriófago vírus6. Em 1985, Smith relatou que fragmentos do gene estrangeiro podem ser fundidos em quadro com o gene que codifica a proteína de casaco do fago III e, portanto, podem ser exibidos na superfície do fago sem comprometer sua infecciosidade7. Estas obras de pioneirismo estabelecido uma base para a posterior construção de bibliotecas do fago-exibido anticorpos imunes, ingênuo, e sintético formulários com o formato de cadeia única variável fragmento (scFv) e fragmento de ligação do antígeno (Fab) para terapêutica mAb desenvolvimento8,9. Do ponto de vista técnico, desenvolvimento de anticorpo baseados na exposição do fago oferece uma abordagem complementar ao desenvolvimento baseado em hibridoma mAb que pode ajudar a contornar as limitações de que alguns antígenos podem representar e a humanização que processar anticorpos derivados do hybridoma exigem muitas vezes5. A partir de 2016, 6 phage display-derivado mAbs foram aprovadas no mercado, incluindo Humira, dentre os mais bem sucedidos mAbs utilizados para tratamento da artrite reumatoide, e muitos candidatos de anticorpo exibição-derivado do fago estão atualmente em vários estágios de clínica investigação10.
Para imunológico e ingênuo do fago anticorpo as bibliotecas, a diversidade de complementaridade-determinando regiões (CDRs) na cadeia leve e pesada é derivada do repertório imune natural (ou seja, de células B). Em contraste, a diversidade de CDRs em bibliotecas de anticorpo sintético do fago é inteiramente artificial. Abordagens sintéticas para construção da biblioteca fornecem controle preciso sobre o design de diversidade de sequência e oferecem oportunidades de estudos mecanicistas da estrutura de anticorpo e função11,12. Além disso, o quadro de bibliotecas sintéticas pode ser otimizado antes da construção da biblioteca para facilitar a jusante, o desenvolvimento industrial em grande escala11,12.
Em 1985, Kunkel relatou uma abordagem de mutagénese baseado em modelo single-stranded DNA (ssDNA) para introduzir mutações local-dirigido em bacteriófago M13 eficientemente13. Esta abordagem foi posteriormente usada extensamente para a construção de bibliotecas do fago é exibido. Oligonucleotídeos de DNA sintetizados quimicamente projetados para introduzir a diversidade na Fab CDRs são incorporados em um phagemid com um modelo de coluna vertebral do anticorpo. Neste processo, o phagemid é expresso como um ssDNA contendo uracil (dU-ssDNA) e os oligonucleotides são recozidos para os CDRs e estendidos para sintetizar o DNA de cadeia dupla (dsDNA) na presença de T7 DNA polimerase e T4 DNA ligase. Finalmente, o ds-DNA gerado pode ser introduzido em Escherichia coli por eletroporação.
Para elevada diversidade, construção de biblioteca do fago-exibido, eletroporação de alta tensão de uma mistura de dois componentes de células electro-competente e covalentemente dsDNA circular fechado (CCC-dsDNA) deve ser preparado cuidadosamente. Et al . Sidhu modificado a preparação de células competentes de electro e DNA de métodos tradicionais e biblioteca melhorou muito diversidade14.
Neste protocolo, descrevemos um método para construção de sintético do fago-exibido Fab bibliotecas com diversidades de 109-1010 obtenível com uma única eletroporação. A Figura 1 mostra uma visão geral da biblioteca de construção incluindo: 1) preparação de alta eficiência de célula electro-competente; 2) extração de dU-ssDNA; 3) método do Kunkel baseado mutagénese dirigida do oligonucleotide; 4) electroporation e cálculo do tamanho da biblioteca; 5) proteína/L base ELISA para dobrar e avaliação de diversidade funcional; e 6) análise de sequências de ADN da diversidade. Todas as cepas, reagentes e equipamentos estão listados na tabela do Material. A tabela 1 mostra a configuração de reagente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para construir a elevada diversidade, fago-exibido Fab bibliotecas, controle de qualidade, pontos de verificação são necessários para monitorar vários estágios do processo de construção, incluindo a competência de células electro-competentes, qualidade do modelo dU-ssDNA, eficiência de CCC-dsDNA síntese, sendo o título após electroporation, Fab de dobramento e diversidade de aminoácidos de CDRs pela análise de sequência de clones Fab-fago.
Alto rendimento e pureza de dU-ssDNA …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores apreciam Dr. Frederic Fellouse do laboratório Sidhu para comentários críticos na construção de biblioteca do Kunkel método com base sintética do fago Fab. Os autores apreciam Sra. Alevtina Pavlenco e outros membros do laboratório Sidhu para ajuda valiosa de alta eficiência electro-competente a preparar células de e. coli e dU-ssDNA de alta qualidade. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant No.: 81572698, 31771006) para DW e pela Universidade de ShanghaiTech (Grant No.: F-0301-13-005) ao laboratório de engenharia de anticorpo.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Referenzen
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