合成のバクテリオファージの建設は合わせた多様性と fab 抗体ライブラリーを表示
Summary
このプロトコルでは、合わせた多様性を持つ合成抗体のバクテリオファージの表示ライブラリの構築の詳細な手順について説明します。合成抗体は、病気の診断、治療に基礎研究から広範なアプリケーションを持っています。
Abstract
基礎研究と医学におけるモノクローナル抗体 (Mab) の需要は毎年増加しています。ハイブリドーマ技術は、1975 年にその最初のレポート以来のモノクローナル抗体開発の支配的な方法をされています。代替技術としてモノクローナル抗体開発のバクテリオファージの表示方法は、ヒュミラ、最初のファージ由来の抗体と 1 つのベストセラーの Mab が 2002 年に関節リウマチの臨床治療のため承認されたのでますます魅力的です。非動物ベースのモノクローナル抗体開発技術、バクテリオファージの表示は抗原免疫原性、人間性、および伝統的なハイブリドーマ技術による抗体の開発から必要とされる動物のメンテナンスをバイパスします。このプロトコルでは 109-1010単一電気穿孔法を用いて得られる多様性を持つ合成工場バクテリオファージ表示のライブラリの構築手法について述べる.このプロトコルで構成されています: 1) 高効率電子有能なセルの準備;2) ウラシルを含む単一座礁させた DNA (デュ ssDNA); の抽出3) クンケル法オリゴヌクレオチド指示された突然変異誘発;4) エレクトロポレーションとライブラリのサイズの計算5) 蛋白質 A/L ベース酵素免疫測定法 (ELISA 折りたたみ) と機能の多様性評価;・ 6) 多様性の DNA シーケンス解析。
Introduction
Mab 基礎研究から疾患の診断、治療に至るまで幅広い用途があります。2016 年時点以上 60 Mab は、自己免疫疾患、がん、感染症1,2の臨床治療のためアメリカ合衆国の食品と医薬品管理 (USFDA) によって承認されています。
1975 年ケーラーとミルスタイン、’ハイブリドーマ’、このテクニックと呼ばれる細胞ソースから単一クローンの特異性の抗体の連続的な生成のための技術、薬および企業3 の礎となってその後の報告で ,4。世代この法によるモノクローナル抗体の抗原の生産、マウス免疫、B リンパ球の抽出、不滅のハイブリドーマ細胞、クローンの選択を形成する骨髄腫細胞と治療への応用のための B 細胞の融合など様々 なステップが必要です。人間性がひと抗マウス抗体 (浜)4,5を避けるために必要です。しかし、この技術の毒素や病原体、非常に節約された蛋白質を含む抗原は mAb 生産5生体内で免疫反応をトリガーに比較的有効であります。
1978 年にハチソンらは単一座礁させたファージ ウイルス6残基の直接変異するオリゴヌクレオチドの使用を報告しました。1985 年、スミスは外国の遺伝子断片が III バクテリオファージのコート蛋白質を符号化する遺伝子とフレームに融合することができ、その感染7を損なうことがなくファージ表面に表示することができますはこうしてを報告しました。免疫、世間知らずで抗体のバクテリオファージの表示ライブラリの後続の建設の基礎を築いた先駆これらと合成形作る単一鎖可変フラグメント (scFv) と抗原結合フラグメント (Fab) の形式の治療モノクローナル抗体開発8,9。技術的な観点からバクテリオファージ表示ベースの抗体開発を提供していますいくつかの抗原をもたらすことができます制限を回避することができますハイブリドーマによるモノクローナル抗体開発に相補的なアプローチと、人間化のプロセスハイブリドーマ培養由来の抗体は、5を必要があります。2016 年現在 6 バクテリオファージ表示由来モノクローナル抗体はヒュミラ、リウマチ性関節炎の治療に使用される最も成功したモノクローナル抗体のいずれかを含む市場に承認されているし、多くのバクテリオファージ表示由来抗体の候補者は現在臨床のさまざまな段階で調査10。
免疫と素朴なバクテリオファージの抗体ライブラリ、多様性の相補性決定の地域 (Cdr) 軽鎖重鎖は自然免疫レパートリー (すなわち、B 細胞から) に由来します。対照的に、合成のバクテリオファージの抗体ライブラリの Cdr の多様性は、完全に人工的です。合成ライブラリ構築への配列の多様性のデザインを正確に制御を提供して抗体の構造の解明のための機会を提供して機能の11,12。さらに、大規模な工業開発11,12下流に、容易にするために図書館の建設前に合成ライブラリのためのフレームワークを最適化できます。
1985 年にクンケルは M13 バクテリオファージにサイト指示された突然変異を効率的に導入する一本鎖 DNA 変異のテンプレート ベース アプローチを報告した13。このアプローチは、phage 表示ライブラリの構築のため広く使用された後。化学的に合成した DNA のオリゴヌクレオチド Fab Cdr に多様性を導入するように設計は、抗体のバックボーン テンプレート phagemid に組み込まれます。このプロセスで phagemid はウラシルを含む ssDNA (デュ ssDNA) として表現され、オリゴヌクレオチドは、Cdr に焼鈍、T7 DNA ポリメラーゼと T4 DNA リガーゼの存在下で二本鎖 DNA (dsDNA) を合成する拡張します。最後に、生成された ds DNA は、電気穿孔法による大腸菌に導入することができます。
高い多様性、phage 表示ライブラリ構築、高電圧電気穿孔法と電子有能なセルの二成分混合物の閉じた円形 dsDNA (CCC dsDNA) を慎重に準備されるべき。シドゥらは、従来から大幅に強化されたライブラリ多様性14DNA と電子有能なセルの準備を変更しました。
このプロトコルでは 109-1010単一電気穿孔法を用いて得られる多様性を持つ合成工場バクテリオファージ表示のライブラリの構築手法について述べる.図 1ライブラリ構築などの概要を示します: 1) 高効率電子有能なセルの準備;2) デュ一本鎖 Dna の抽出3) クンケル法オリゴヌクレオチド指示された突然変異誘発;4) エレクトロポレーションとライブラリのサイズの計算5) A/L ベース ELISA のための蛋白質折りたたみと機能の多様性評価;・ 6) 多様性の DNA シーケンス解析。すべての試薬、緊張および機器は、材料のテーブルに表示されます。表 1は、試薬のセットアップを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
電子有能なセル、デュ ssDNA テンプレート、効率性の能力を含む建設プロセスのさまざまな段階を監視する必要がチェック ポイント高い多様性、Fab ライブラリのバクテリオファージ表示、品質管理を構築するにはCCC dsDNA 合成、エレクトロポレーション、Fab 折りたたみと Fab phage クローンの解析から Cdr のアミノ酸の多様性後価。
高収量とデュ ssDNA の純度高い突然変異率?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、シンドゥ ラボ クンケルの法合成工場バクテリオファージ図書館建設に批判的なコメントから博士フレデリック Fellouse を感謝しています。著者夫人 Alevtina Pavlenco と高効率電気主務の準備の貴重な助けのシドゥ ラボから他のメンバーに感謝エシェリヒア属大腸菌のセルと高品質デュ ssDNA。この作品は中国の国家自然科学基金によって支えられた (グラント号: 81572698、31771006) DW と ShanghaiTech 大学 (グラント号: F-0301-13-005) 抗体工学研究室に。
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Referenzen
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