Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

A barreira sangue – cérebro é uma interface rigidamente controlada entre o sangue e o cérebro que determina o que entra e sai do cérebro. Anatomicamente, células endoteliais compõem a barreira sangue – cérebro e formam uma rede capilar complexa, contínua. Fisiologicamente, essa rede capilar fornece o cérebro com oxigênio e nutrientes ao simultaneamente eliminação de dióxido de carbono e produtos de resíduos metabólicos. Importante, a evidência suporta que as alterações para a barreira contribuam para inúmeras patologias, incluindo a doença de Alzheimer, epilepsia e acidente vascular cerebral^{1,2,3,4,5 , 6 , 7}. cérebro células endoteliais também servem como uma barreira ao tratamento, bloqueando a absorção de drogas no cérebro, por exemplo., quimioterapia de glioblastoma multiforme seguindo tumor ressecção^{8,9, 10}. a este respeito, os capilares do cérebro humano isolado representam um único ex vivo modelo de barreira hemato – encefálica que se assemelha a barreira propriedades in vivo, que permite o estudo da função de barreira e disfunção em saúde e a doença. Neste artigo, nós fornecemos um protocolo para isolar os capilares do cérebro do cérebro humano em um capilar de consistentemente de alta qualidade e rendimento para estudar a barreira sangue – cérebro.

Em 1969, Siakotos et al. ¹¹ foram os primeiros a relatar o isolamento dos capilares do cérebro do tecido cerebral bovina e humana usando densidade gradiente centrifugação e vidro do grânulo coluna separação. Mais tarde, Goldstein et al. ¹² melhorado este método adicionando várias etapas de filtração para diminuir a quantidade de tecido necessário para estudar os capilares do cérebro isolados de ratos, mantendo a atividade metabólica de transporte de glicose. Desde então, pesquisadores otimizado o procedimento de isolamento capilar inúmeras vezes, melhorar o modelo capilar método e cérebro com cada iteração^13,14,15. Por exemplo, Pardridge et al. ¹⁶ isolado bovina capilares usando digestão enzimática, ao invés de homogeneização mecânica e posteriormente passou uma suspensão capilar através de um filtro de malha de 210 µm e uma coluna de vidro do grânulo. Essas modificações melhoraram a mancha de exclusão trypan azul dos capilares do cérebro isolado e assim, aumentaram a viabilidade celular endotelial. No início de 1990, Damasceno et al. ¹⁷ isolado bovina e rato capilares que eram claras de contaminação neuronal e mantida a atividade metabólica de γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) e fosfatase alcalina. Em 2000, Miller et al. ¹⁸, usado isolado de rato e capilares do cérebro suínos em combinação com microscopia confocal para mostrar o acúmulo de substratos de transporte no lúmen dos capilares. Posteriormente, nosso laboratório tem continuado a otimizar o processo de isolamento capilar do cérebro e nós estabelecemos transporte ensaios para determinar a P-glicoproteína (P-gp)^19,20,21, câncer de mama resistência da proteína (BCRP)^22,23e proteína de resistência a múltiplas drogas 2 (Mrp2)²⁴ atividade de transporte. Em 2004, publicou dois relatórios onde costumávamos capilares de cérebro de rato isolado para investigar diversas vias de sinalização. Em Hartz et al. ²¹, encontramos que o peptídeo endotelina-1 reversível e rapidamente reduzida função de transporte de P-gp em capilares cerebrais, actuando através do receptor (ET_B) do receptor B de endotelina, óxido nítrico sintase (NOS) e proteína quinase C (PKC). Em Bauer et al . ¹⁹, temos demonstrado que a expressão do receptor nuclear receptor pregnane X (PXR) e mostrou PXR-modulação da função de expressão e transporte de P-gp em capilares do cérebro. Em experimentos com ratos transgénicos de PXR humanizados, nós expandidos nessa linha de pesquisa e mostrou na vivo de aperto da barreira por estrogenos P-gp através da ativação de hPXR²⁵. Em 2010, Hartz et al. ²⁶ usado essa abordagem para restaurar a expressão da proteína de P-gp e transportar a atividade em ratos transgénicos precursora amiloide humano proteína (hAPP) overexpress hAPP. Além disso, restaurando a P-gp no hAPP ratos reduziram significativamente níveis de cérebro de₄₂Aβ e beta amiloide (Aβ)₄₀.

Além de estudar a sinalização de caminhos, capilares de cérebro isolado podem ser usados para determinar as alterações na permeabilidade capilar que nos referimos como vazamento capilar. Em particular, o ensaio de fugas de Texas Red é usado para avaliar o escapamento do corante fluorescente Vermelho Texas do lúmen capilar ao longo do tempo e estes dados são usados para analisar taxas de fugas. Taxas de vazamento capilar aumentada em comparação com aqueles dos capilares de controle indicam alterações na integridade física da barreira hemato – encefálica². Isto é valioso porque existem numerosos estados patológicos associados rompimento da barreira, por exemplo., epilepsia, esclerose múltipla, doença de Alzheimer e cerebral traumática lesão^{27,28,29, 30}. Outros grupos também têm utilizado isolados capilares para discernir as vias de sinalização que regulam a expressão de proteínas e atividade de transporte de proteínas^{31,32,33,34, 35,36,37}. Finalmente, continuamos a otimizar esse método para o isolamento dos capilares do cérebro humano e, recentemente, mostramos a expressão aumentada de P-gp no humana barreira hemato – encefálica, em pacientes com epilepsia, em comparação com indivíduos de controle livre de apreensão³⁸ . Tomados em conjunto, estes desenvolvimentos demonstram que os capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo versátil para estudar a função de barreira.

Vários in vivo, ex vivoe em vitro barreira hemato – encefálica modelos têm sido utilizados em pesquisa básica e rastreio de drogas industriais, principalmente com o objetivo de testar a entrega da droga para o cérebro^{39,40,41 ,42,},^43,44. Além de isolados ex vivo capilares do cérebro, modelos atuais da barreira hemato – encefálica incluem modelos em silico , em vitro cultura celular de células endoteliais capilares do cérebro isolado ou linhas de células imortalizado de vários espécie, em vitro de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) que se diferenciar em células endoteliais capilares do cérebro e microfluidic modelos em um chip.

In silico modelos são mais usados no desenvolvimento de drogas para a seleção de candidatos a fármacos com base no previsto de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) Propriedades. Métodos como modelos de relacionamento (QSPR) estrutura-Propriedade quantitativa e quantitativa estrutura-atividade relação (QSAR) são métodos populares usados na seleção da elevado-produção de bibliotecas para prever a penetração do cérebro de candidatos da droga ^{45 , 46}. estes modelos são úteis para moléculas de tela para propriedades de penetração da barreira.

Betz et al ⁴⁷ estabeleceu monocamadas de células endoteliais capilares do cérebro culta como um sistema de modelo em vitro barreira hemato – encefálica. Em vitro celular cultura modelos usando tecido fresco ou linhas de células endoteliais imortalizado como células endoteliais microvessel cerebral humana (hCMECs) podem ser outra ferramenta de seleção da elevado-produção para penetração do cérebro ou estudos mecanicistas. No entanto, modelos de cultura de células endoteliais capilares cerebrais faltam a tensão de cisalhamento fisiológico do fluxo de sangue para dentro do lúmen capilar, estão limitados a complexidade geral biológica e se submetem a mudanças na expressão e localização de componentes importante barreira como proteínas de junção apertada, íon, transportadores, enzimas e receptores de superfície canais^48,,^49,50. Inversamente, monocamadas endoteliais derivado hPSCs, tem permeabilidade de sacarose baixa em comparação com as culturas hCMEC/D3 e conter expressão polarizada de alguns transportadores barreira hemato – encefálica, moléculas de adesão e junções apertadas^{51, 52}. no entanto, essas células também estão sujeitos a alteração de propriedades na cultura, e o sistema deve ser validado para sua recapitulação na vivo Propriedades barreira⁵².

Mais recentes tendências em pesquisa da barreira hemato – encefálica incluem utilizando sistemas de cultura de tecido 3D para criar capilares artificiais, usando a tecnologia do órgão-on-chip para gerar dispositivos microfluídicos, ou utilizando a tecnologia de fibra oca^{53, 54 , 55}. capilares artificiais, no entanto, têm significativamente maiores diâmetros (100 – 200 µm) do que o cérebro os capilares (3 – 7 µm). Daí, o cisalhamento forças em vitro não totalmente se assemelham a situação na vivo . Esta mensagem é dirigida em dispositivos microfluídicos “blood-brain-barrier-on-a-chip”, onde os compartimentos de “sangue” e “cérebro” de forma artificial de membranas e fluidos são bombeados através destes dispositivos, gerando forças de cizalhamento microfluidic. Da mesma forma, co culturas de células de músculo liso vascular e células endoteliais em várias combinações com astrócitos também têm sido usadas com a tecnologia de fibra oca para recriar reológicos parâmetros presentes na vivo condições^{56 , 57 , 58}. no entanto, desconhece-se o quanto este modelo reflete outras propriedades da barreira sangue – cérebro, tais como transporte, metabolismo, sinalização e outros. Estes modelos capilar e chip artificiais são adequados para seleção da elevado-produção de drogas, mas as células usadas para gerar esses modelos também estão sujeitos a alterações durante a cultura.

Fatias de cérebro congelado e fixo ou cerebrais primários, culturas de células endoteliais capilares são modelos adicionais que podem ser usados paraestudar a microvasculatura humana^5,59,60,61. Por exemplo, imuno-histoquímica do tecido cerebral fixa é usada para determinar a localização da proteína, e a expressão em saudável em relação ao tecido doente.

Além de fatias de tecido e os modelos em vitro capilares do cérebro descrito acima, recentemente isolados podem ser utilizados para estudar a função da barreira hemato – encefálica. As limitações deste modelo capilar isolada incluem a dificuldade para obter o tecido do cérebro humano fresco, ausência de astrócitos e neurônios e um processo de isolamento relativamente demorado. Uma vantagem do modelo capilar cerebral isolado é que este modelo se assemelha a situação na vivo e, portanto, pode ser usado para caracterizar a função de barreira e disfunção. Importante, ele também pode ser usado para discernir os mecanismos de sinalização usando uma infinidade de ensaios e técnicas moleculares^3,19,,^62,63.

Nosso laboratório tem acesso a ambos os tecidos frescos e congelados do cérebro humano através do centro de Sanders-Brown sobre o envelhecimento (IRB #B15-2602-M)⁶⁴. Neste contexto, as autópsias seguem um protocolo padrão, cérebros são obtidos em < 4h e todos os procedimentos estão em conformidade com diretrizes de melhores práticas NIH Biospecimen⁶⁵. Dado este acesso exclusivo ao tecido do cérebro humano, estabeleceu e otimizado um protocolo para isolar os capilares do cérebro do tecido do cérebro humano que resulta em um alto rendimento dos capilares do cérebro humano intacto, viável. Dois pontos de extremidade comuns de interesse são para determinar a expressão da proteína e atividade. A este respeito, nós e os outros estabeleceram vários ensaios que podem ser usados com os capilares do cérebro isolado para estudar a expressão da proteína e níveis de atividade. Estes ensaios incluem mancha ocidental, ensaio de Western simples, ensaio imunoenzimático (ELISA), reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), zimografia, ensaios de atividade de transporte, e ensaios de vazamento capilar. Estes ensaios permitem aos pesquisadores estudar alterações na função de barreira em condições patológicas humanas, determinar caminhos que regem a atividade e expressão da proteína e identificar alvos farmacológicos para o tratamento da barreira hemato – encefálica associada doenças.

Tomados juntos, recentemente capilares do cérebro isolado podem servir como um modelo robusto e reprodutível a barreira sangue – cérebro. Especialmente, este modelo pode ser combinado com muitos ensaios diferentes para determinar uma grande variedade de pontos de extremidade para estudar a função de barreira.