透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

“CryoWriter”(図 2; 詳細は以前仕事24,26,27を参照してください) または同等の計測は以下のプロトコルに必要な。主な部品と消耗品のサプライヤーのリストは、材料の表で与えられます。 1. ネガティブ染色 (NS) グリッドの準備 計測器をオンにし、ソフトウェアを起動します。すべての必要なモジュール (シリンジ ポンプ コント ローラー、電動ステージ、監視カメラ、および露点ステージ) を初期化します。 クールなサンプルのサポートと露点ステージ。必要な場合は、露点段階温度調節されていることを確認、露点より 1-2 ° C。注意: ステージは PID コント ローラーを持つ商業ペルチェ素子によって冷却されます。 NS を準備するには、(例えば、タングステン酸 2% メチルアミン市販) NS の 100-150 μ L で、100 または 200 μ L の PCR チューブを充填します。計測器の冷却サンプルのサポートにチューブを置きます。 サンプルを配置します。 サンプルを置く (0.5 ~ 1 μ M) を 100 または 200 μ L の PCR チューブ。未満 50 μ L のサンプルが利用可能な場合、かみそりの刃で PCR チューブの下部を切断し、サンプルとしても使用します。これにより、マイクロキャピ ラリーがサンプルを簡単に達することができます。注: 後でサンプルを吸引に使用マイクロキャピ ラリーが少し傾いている、旅行高さ z 軸方向は限られているので、100 または 200 μ L の PCR チューブからサンプルを吸引する簡単です。 蒸発を防ぐために装置で冷却サンプルのサポートに PCR チューブ/コンテナーを配置します。サンプルが吸気して室温; 顕微鏡ステージ トップ インキュベーターでもプレートからまた、冷却は、ウェル プレートには実装されていません。 位置を定義します。電動 xy ステージと直線 x、y、および z 軸ステージ、マイクロキャピ ラリーを配置するためのソフトウェア制御ボタンを制御する cryoWriter ジョイスティックを使用します。カメラを使用すると、毛細血管の位置を確認します。 サンプル保存容器に、マイクロキャピ ラリーを移動します。サンプル液に先端を浸すし、「サンプル」としてこの位置を保存します。 NS PCR チューブに、マイクロキャピ ラリーを移動、NS ソリューションに先端を浸すし、「汚れ」としてこの位置を保存します。 マイクロキャピ ラリー約 100 μ m は、EM グリッドが配置され、”grid_save”としてこの位置を保存するスロットの中央上に配置します。 サンプルを吸引し、NS EM の状態します。 インストールされていない場合は、高精度シリンジ ポンプの 10 μ L のシリンジ (0.46 mm 内径) をマウントします。 30 cm 長い石英マイクロキャピ ラリー (外径 360 μ m、内径 150 μ m) 注射器のコンセントの片方の端を接着します。 プレス フィット コネクタ経由での他の短い (5 cm) マイクロキャピ ラリーの末長いテーパー マイクロキャピ ラリーを接続します。短いマイクロキャピ ラリーのテーパーの先端は、調剤の先端を形成します。 脱のダブル蒸留水 (ddH2O; システム液体) で注射器を記入し、気泡の形成を避けるため。 調剤システムの液体の nanoliters の数十、糸くずティッシュでマイクロキャピ ラリーからの低下を取り外します。 保存されたサンプルの位置をダブルクリックします。よく、これはサンプルで、マイクロキャピ ラリーを配置します。毛細血管が動いている間調剤 3 × 0.5 nL マイクロキャピ ラリー チップは、空気の泡が (下記のメモ 2 を参照) が閉じ込められているを防ぐためにサンプルに浸漬する前にちょうどシステムの液体の。 サンプルの吸引 5 nL。 保存されている NS 位置をダブルクリックします。マイクロキャピ ラリー サンプル容器から、NS 貯水池へ自動的に移動します。3 × 0.5 を手動で調剤毛細血管が動いている間先端は空気がないことを確認する貯留層に浸漬する前にちょうどサンプル液の nL の泡 (下記のメモ 2 を参照)。注:重要: (1) シリンジ ポンプの歯車のバック ラッシュをためピストンのストロークで小さな損失がある吸引したり調剤モードから切り替えたとき。メーカーによると新しいユニットのバック ラッシュは 7 と 12 μ m の間にあります。これは、0.46 mm のバレル径のシリンジ 1 2 nl ということを意味します。そのため、1-2 nL 省くことができる””、サンプルは実際に調剤する前に。通常、小さな液滴に起動 3 0.5 後マイクロキャピ ラリー チップを終了し nL ディスペンス手順。(2) サンプルの上/下に閉じ込められた気泡はより少なく正確な調剤を行うだろうし、拡散によってサンプルをご利用いただけますを防ぐ。 サンプル バッファーとノズル形状に応じて、3-12 分間浸漬マイクロキャピ ラリーを残します。注: より高い塩やリン酸塩濃度バッファーに必要な浸漬の時間が長くなります。NS (比較的早く) バッファー塩 (比較的高速) とタンパク質サンプル プラグに拡散する拡散反射光アウト (時間がかかる)。これは、読み込まれたグリッドが乾くときの結晶化を防ぐサンプル バッファー塩の濃度を下げます。さらに、リン酸は、NS との組み合わせで沈殿物を形成する傾向があります。 グリッドを準備し、エアコンのサンプルのスポットを入金します。 サンプルは調節されている粘着テープと PDMS ブロックの部分を取り、適用およびほこりがないように粘着テープを削除して、PDMS の上面をきれい。PDMS ブロックをシャーレに入れてください。注: 新しい PDMS ブロックはクリーン ルームから取得されます。 慎重にグリッドを拾う (例えばCu, Parlodion/C 皮膜で被覆された 200 または 400 メッシュ)。ピンセットでグリッドの端のみをタッチしてください。上向きカーボン フィルム クリーン PDMS ブロック上に置きます。 場所空気圧グロー放電ユニットと輝きのグリッドと PDMS ブロック放電 20 0.4 mbar で 100 W 電源付き。閉じたペトリ皿にグリッドを格納します。グロー放電時間が長く一般にグリッド上の堆積したサンプル ボリュームの大きい広がりに します。その結果、汚れの層が薄くなる (弱い染色)。 cryoWriter ピンセットでグロー放電グリッドを把握する前に浸漬時間を 1 分に。電磁石がオンかどうかを確認します。それ以外の場合、ソフトウェアでそれをオンします。電磁石にピンセットをマウントし、露点ステージ、カーボン フィルム側を上にグリッドを配置する手動マイクロマニピュレーター ネジを使用します。露点段階温度調節されていることを確認してください 1-2 ° C の露点上サンプルが読み込まれた後に蒸発の率を減らすため。 浸漬時間は場合、は、”grid_save”をダブルクリックします。マイクロキャピ ラリー チップは、グリッド表面上安全に配置されます。手動でグリッドと接触するマイクロキャピ ラリー チップをもたらします。10 μ m でノズルを持ち上げて、中央上に配置。注意:洗剤を含むいくつかのサンプルは、低い表面張力により液体が分配されるとき、マイクロキャピ ラリーの外側面に沿って上に移動する傾向があります。このような損失を防ぐためにグリッド表面の近くに非常に重要です。 5 分配グリッド上にサンプルの nL。1 つはサンプルが非常にヒントになるまでまたゆっくりと分配でき、5 をすばやく分注で乾燥した日、とき急速な蒸発が起こりマイクロキャピ ラリー チップで、nL。 露点ステージ (DP ステージ) でゆっくりと乾燥条件のサンプルをマイクロキャピ ラリーを撤回します。 一度サンプル スポットが乾燥しているは、グリッドを取り出してグリッド ボックスまたはペトリ皿に室温で保管します。 500 を分配、マイクロキャピ ラリーからシステムの液体の nL と糸くずの組織でそれを削除します。エタノール、洗剤や 1 M NaOH で 5 回毛細血管をフラッシュします。これは、別のサンプルで使用することができますマイクロキャピ ラリーをクリーンアップします。 2. 低温グリッドの準備 装置および試料を準備するには、手順 1.1 から 1.5 上記に従います。NS する必要がない場合は、1.3 と 1.5.2 の手順を省略します。サンプル バッファーを交換または透析による低温電子顕微鏡のサンプルの条件、例えばバッファーの濃度を低減する塩か紹介する添加剤 (例えばトレハロース、洗剤) 目的のバッファー代わりに使用 NS 手順 1.3 と 1.5.2 で。 標準的な低温コンテナーにおける液体エタンを準備します。 エタン カップ、クライオ ボックス ホルダーとクモをアセンブルし、液体窒素であふれんばかりに寒剤容器を満たし通常約 200 mL が必要です。エタン カップ下がったし、は液体窒素の無料まで、数分待ってください。 エタンのガスボンベを開き、ゆっくりとエタン カップにガスの流れを聞かせてください。レベルがトップ下 2-3 mm になるまで液体エタンを満たしてくれこれは数分かかります、約 5 mL の液体のエタンが必要です。 クライオ ボックスを取り出して寒剤コンテナーの空きスロットにします。 クモを削除、上では、ポリスチふたを閉めて、cryoWriter で取り付けの寒剤容器を置きます。 グロー放電 EM グリッド。 粘着テープ、ポリジメチルシロキサン (PDMS) ブロックの部分を取り、適用し (任意のほこりを削除します) 粘着テープの取り外し上面 PDMS をきれい。PDMS ブロックをシャーレに入れてください。 慎重にグリッド ボックスからグリッドを選択します。ピンセットでグリッドの端のみをタッチしてください。上向きホーリーファイバー カーボン フィルム クリーン PDMS ブロック上に置きます。 場所、PDMS プラズマ クリーナーとプラズマ クリーニングのグリッドとグリッドの表面 (例えば使用 75% Ar/25% H2、パワー 50 W、圧力 25 mTorr) をブロックします。ペトリ皿でグロー放電グリッドと PDMS ブロックを配置します。 楽器でグリッドを位置します。 CryoWriter ピンセットでグロー放電グリッドを把握します。電磁石がオンかどうかを確認します。それ以外の場合、ソフトウェアでそれをオンします。電磁石にピンセットをマウントし、手動マイクロマニピュレーター ネジを使用してステージ、カーボン フィルム側にフラットをグリッドに合わせます。 “Grid_save”をダブルクリックします。約 10 μ m のグリッド サーフェス上に先端があるのでマイクロキャピ ラリー位置を調整します。マイクロキャピ ラリー自由に移動できるグリッド上で任意の場所、それに触れることがなく必要に応じて撤回のマイクロキャピ ラリー数マイクロ メートル場合ことを確認します。 グリッドの中心に戻って、「グリッド」として新しい位置を保存します。注意:正しい名前を付けるマクロ スクリプトを動作するために必須です。 サンプルとプランジ凍結グリッドを記述します。 システム液晶の nanoliters の数十のマイクロキャピ ラリーをフラッシュ、糸くずティッシュでマイクロキャピ ラリーからの低下を取り外します。 マクロ スクリプトを起動します。マクロは、次の手順を行います。 5 分配 (先端に空気の泡を削除) する nL サンプル位置に行く。 サンプルの吸引 65 nL。5 を吹き込む nL サンプル チューブに戻る。このアカウントは、システムのバック ラッシュ、すなわち同期書き込みが許可します。 その調剤を確保して同時に動きの開始をステージに。 「グリッド」の位置に移動します。 ‘文章のパターン」は、同時に調剤 45 グリッド上で移動するマイクロキャピ ラリーになりますを開始サンプルの nL。 その後、グリッドの中央に戻って、マイクロキャピ ラリーを移動別 10 μ m、それを下げるし、過剰なサンプル液を撤回します。 マイクロキャピ ラリーを撤回し、電磁石をオフにします。これは凍結ピンセットや開始のプランジを解放します。 グリップのピンセットとプランジャーから磁気のアダプターを慎重に取り外します。すぐにクライオ ボックスを含む寒剤容器にエタン カップからグリッドを転送し、空きスロットに、グリッドを配置します。 3. 単一セル Lysate の準備 エレクトロポレーション用、microcapillaries を準備します。注: テーパ (レーザー プルと検査) 石英 microcapillaries コーティングが先細りのプロセス中に降りて焼けは、先端を除いて、外側の保護ポリイミド コーティングがあります。 導電性層で microcapillaries をコートにそれらをマウント 45 ° の角度で金属製のレールに上向きのヒント。ノンコート ポリイミドがプレス フィット コネクタが後で採用されている最高のシールを形成するよう、先端の下端 (2 cm) を盾にアルミ箔を使用します。 スパッタ預金 20 の粘着層 nm Ti/W と Pt、200 nm 厚の層。 マイクロキャピ ラリー チップを疎水性にします。 1-ドデカンチ エタノールの 1 M 溶液を準備します。 グロー放電 0.4 mbar で 100 W の電源と 1 分のための空気でマイクロキャピ ラリー。 数時間 (理想的には一晩) 1-ドデカンチの 1 M 溶液でマイクロキャピ ラリーの先端を浸します。注: 使用する前に 1 日新鮮なヒントを準備するお勧めします。 新しいマイクロキャピ ラリーをインストールします。 1-ドデカンチ ソリューションから、マイクロキャピ ラリーを削除すすいでエタノールと外をエタノール注射器を使用して内側を洗い流します。注: 機能性 microcapillaries を使用できない場合すぐにグロー放電、マイクロキャピ ラリーの先端と PDMS と硫酸の混合物である商用車の窓辺の演出のドロップに浸し。1-ドデカンチが一般的に十分な結果疎水性官能基化はないも同然です。 キャピラリー カッターでコーティングされていない端を切断します。注: クリーン カットはプレス フィット コネクタと良好なシールにとって重要です。 ポリイミド コーティング レーザーによって、毛細血管を引っ張って中にに焼かれたときガラス、ポリイミド塗膜間に形成されたシャープなボーダーに銀ペーストを適用するのにには、つまようじを使用します。注: この補強は必要 Pt コーティングはこの地域で非常に弱い、電気伝導を簡単に打破することができます。 ポリイミド末アセトンでマイクロキャピ ラリーを洗います。最後にアセトンの小さなドロップを残すし、プレス フィット コネクタの開口部に挿入します。良好なシールを形成する光の圧力を適用されます。 マイクロキャピ ラリー位置を調整します。 計測器をオンにし、手順 1.1 で説明されているように、ソフトウェアを起動します。さらに、顕微鏡カメラとファンクション ・ ジェネレーターを初期化します。 顕微鏡でスライド ホルダーにガラス顕微鏡スライドを配置します。 スライド ガラスに近いマイクロキャピ ラリーを下げるし、顕微鏡カメラ ビューで表示されるまで対物レンズを中心に。X と y 軸リニア ステージを使用して、画像の中心に、マイクロキャピ ラリーの先端を配置します。それが少しスライド ガラスに触れるまで、徐々 に先端が低きます。注意:ファイナル アプローチに向けて非常に小さなステップ (5 μ m) を選択します。先端が破損することができます。 「ノズルの調整」ボタンをを押します。これは、リトラクト、マイクロキャピ ラリー 40 mm とセットとしてこの位置をホーム ポジション。 スライドのスタンプの PDMS 作品や伊藤の準備 ミックス PDMS、10:1 の比率で架橋剤ハイブリダイゼーション インキュベーターまたは同様のデバイスにいくつかの時間の深さの約 2-3 mm。 焼く 60 ° c に大きいペトリ皿に注ぐ。 ハンマーとスタンプ (直径 12 mm)、PDMS 層の穴をカットします。その後、メスを使って 2 cm 長い正方形または長方形の顕微鏡のスライドに合わせてスタンプの部分を取得する穴を含むをカットします。通常、2 つのスタンプ部分は 1 つの顕微鏡のスライドにマウントされます。 PDMS 作品と伊藤スライド最初洗剤とし、70% エタノールを洗います。60 ° C のオーブンでそれらをぬれた、ペトリ皿と聞かせて、エタノールで完全に蒸発させる場所 グロー放電 0.4 mbar で 100 W の電源と 1 分のため伊藤スライドし、コーティング溶液 (例えばポリ-L-リジン (PLL)) 1 mL を適用します。5 分間インキュベート、ピペットとソリューションを削除、ddH2O をわずか 1 ml 1 分の運動を扇動し、ddH2ピペットを使用して O を削除します。60 ° C で乾燥のスライドを聞かせてください。 細胞培養を準備します。次の標準的な付着性細胞培養のプロトコル (例えばアーノルド、ら24,25). 通常分割継実行中に伊藤に細胞を播きます。 伊東の新鮮な PLL コート スライドを取るし、PDMS の作品を追加します。防水シールを形成するいくつかの圧力を適用されます。これは彼らの基盤としてスライドと小さな井戸を生成します。 PDMS の井戸に新鮮な媒体中に浮遊細胞の約 300 μ L を追加します。播種密度は、ウェルあたり約 75,000 セルをする必要があります。 伊藤スライドを標準的な条件の下で 1-2 日にインキュベートします。 セル換散の実験の準備を。 エレクトロポレーション バッファー (例えば、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)) の数ミリリットルをあらかじめ温めます。 NS EM グリッドの準備のためのセットアップを準備します。注: 手順 1.1 1.5 (NS) のまたはステップ 2.1 2.4 (低温) のためのセットアップを準備するための詳細のとおりです。ここで我々 は NS 準備の最も重要な手順を説明します。 NS を準備するには、(例えば、タングステン酸 2% メチルアミン市販) NS の 100-150 μ L で、100 または 200 μ L の PCR チューブを充填します。計測器の冷却サンプルのサポートにチューブを置きます。 NS PCR チューブに、マイクロキャピ ラリーを移動、NS ソリューションに先端を浸すし、「汚れ」としてこの位置を保存します。 標準的な溶解パラメーター、例えば、換散電圧をロードします。 インキュベーターから伊藤スライドを取り出して顕微鏡挿入でそれをマウントします。アルミニウム挿入時のスライドを修正したり、伊東間の電気接触を確保する 2 本のネジを使用して、スライドと電気的に接地されたアルミ フレームの塗装します。 細胞培養培地を外し、エレクトロポレーション バッファーの 300 μ L で 2 回洗います。エレクトロポレーション バッファー内の細胞を維持します。 セットアップの生細胞インキュベータ段階で伊藤スライドを保持アルミニウム挿入を配置します。 顕微鏡ビューで細胞培養を検索し、セルがいない領域を選択します。ITO 表面に先端に近づくとそっと触って、ヒント 100 μ m を撤回し、「セル」としての地位を保存します。 すぐに細胞培養を残すシステム液体の nanoliters の数十でマイクロキャピ ラリー チップをフラッシュし、細胞培養に再びそれを置きます。PDMS もない空気の泡が先端に閉じ込められていることを確認するに浸漬中にいくつかの nanoliters を調剤します。 ITO 表面にそっと近づく (当初は、すなわち「セル」の位置にする必要があります。、100 μ m 表面上)。時に連絡先、ヒント 10 μ m を撤回します。 換散のための近くのセルを選択します。マイクロキャピ ラリー ターゲットのセルの上のヒントの場所。 単一のセル換散のためマクロ スクリプトを起動します。 名位置、マイクロキャピ ラリーは、セルが正常に分離された後に移動する必要があります。これは NS の貯水池 (NS EM)、脱塩バッファー (Cryoem) または EM グリッド (Cryoem) になります。スペル ミスを回避し、”ok”を押します。 マクロは、ユーザーの介入なし進みます。 i) 顕微鏡ステージと細胞文化 100 μ m、左側に標的細胞のスナップショットは、移動、マイクロキャピ ラリーから ddH2O システム液体の撮影、および 50 nL が分配されます。これは転置し高塩バッファーが薄れて、浸透圧をセルに適用します。 ii) ステージは再び標的細胞上の先端の位置に戻されます。定義済み電圧バーストが適用され、3 を吸引するポンプ システムを開始 500 ms 後 2 μ L/分の流量でサンプルの nL。 iii) のステージは、検査する再度、左に移動されます。ユーザーの入力を求めるウィンドウが表示されます。 散のステップが成功したかどうかと言います。 答えは、いいえ、引き継ぐ、フラッシュ、マイクロキャピ ラリーと新しい細胞をターゲットかどうか。 答えが yes の場合削除 (分離) セルのスナップショットが作成され、その後、マイクロキャピ ラリーは 3.8.1 で指定された場所に移動します。NS またはバッファー貯水池場合は、3 × 0.5 を分配する標準のユーザー インターフェイスを使用して、気泡がないことを確認する、マイクロキャピ ラリー中の液体の nL を移動します。先端は、マクロによって貯留液中浸漬します。注: サンプル 1.6.9 – NS EM、セクション 2.2 2.6 Cryoem 1.7.9 のセクションで説明したように、グリッドを準備する続行できます。以下では、NS-グリッドの準備に必要な手順を説明します。 浸漬ノズル形状に応じて、8-12 分マイクロキャピ ラリーを残す注: バッファーの高いリン酸濃度調節のためより長い浸漬時間が必要です。 5 分配条件セル グリッド上に lysate の nL。 マイクロキャピ ラリーを撤回し、露点温度以上 1-2 ° C を規制しましょう露点ステージ (DP ステージ) でゆっくりと乾燥条件のサンプル。 グリッドを削除し、グリッド ボックスまたはペトリ皿に室温で保存します。