96井格式人诱导多潜能干细胞源神经元高速拉伸损伤的方法

1. 硅胶排毒 用剃刀刀片和丙烯酸模板将254µm 厚, 30.48 厘米 x 30.48 厘米硅膜切成7.5 厘米 x 11 厘米的矩形。每张纸可以制作10个矩形膜。保存带有硅胶的纸张。 用玻璃器皿肥皂将膜放在一浴缸的去离子水中。一次, 用戴手套的指尖用力擦洗细胞膜至少二十年代或直到激动。 冲洗膜下运行的 DI 水, 直到激动肥皂明显删除。将薄膜放在纸上 (从包装上) 和高压釜上的重力循环。 将每层250毫升70% 乙醇的硅膜浸泡在 60 rpm 24 小时的轨道振动筛上. 使用由不与乙醇反应的材料制成的容器, 如聚丙烯。 如果一个以上的膜被放置在一个单一的纸盒, 或如果膜粘在底部的垃圾桶, 分离的膜, 从他们的环境与塑料吸管的提示和吸管尖架。 将带手套的硅胶膜转移到每膜250毫升的 DI 水中, 在 60 rpm 处浸泡48小时的轨道振动筛。 把薄膜放回纸上, 放在93摄氏度的玻璃器皿烤箱里, 4 小时。 把膜放在纸上, 放在干净干燥的地方, 盖上另一张纸, 以防灰尘。 2. 板材制造 等离子体处理一个96井板顶部与一个 200 W 等离子清洗器 (参见材料表) 在六十年代的大功率, 把它的底部侧向上等离子清洗器。检查通过会议厅的窗口可见的紫色辉光, 表明有效的等离子已经形成。这种结合技术是从 Sunkara等。14 在六十年代内, 将板顶在200毫升 1.5% (3-氨基丙基) triethoxysilane (APTES) 在 DI 水中20分钟, 底部侧向下。这个解决方案是不稳定的: 准备它不超过六十年代之前推出的板块。注意事项: 与 APTES 在通风罩中工作。 等离子体处理在六十年代等离子清洗剂中提取的硅膜的大功率。时间的等离子治疗, 使其完成不超过5分钟之前的20分钟的时间在步骤2.2。 使用镊子将等离子处理的膜放置在 7.5 x 11 厘米2羊皮纸纸矩形的顶部。将7.5 厘米 x 11 厘米 x 0.5 厘米的铝板对准板制作夹具的下部。用镊子将硅膜和羊皮纸对准铝板。注: 此设备的计算机辅助设计 (CAD) 文件在补充材料中作为辅助代码文件 “按模-通用 3D” 提供。步 ‘。关联的物料清单在辅助表 1: 自定义生成的设备-BOM. xlsx中提供。 从 APTES 浴缸中取下板顶, 并摆脱多余的溶液。浸泡在200毫升的水浴 5 s 和摆脱过剩的水。浸泡在不同的200毫升的水浴 5 s 和摆脱过剩的水。在浸泡另一盘前, 先更换浴缸中的水。 使用压缩空气完全干燥的板材顶部。 将板材顶部放在板制作夹具的上部。轻轻地关闭板制作夹具, 按板顶和硅胶一起。钳位至少1小时。 在使用前, 请允许钢板在室温下固化24小时, 防止灰尘。 3. 拉伸板 清洁平头。注意: 请参阅辅助图 1。 在室温下准备 60 W 浴式 sonicator 与 DI 水。 支持 sonicator 浴以上的压块, 倒置, 以便只有平头的顶部被淹没到至少1毫米的深度. 油脂实验平头8分钟42赫。 用压缩空气吹干平头。 对齐压块。 将照相机放在拉伸装置上方, 使其向下看压阵列。集中在平头的顶端。注: 4 节中描述的 “膜拉伸特性” 的设置是此任务的一个可能的相机设置。 使用舞台夹具 (图 1) 在受伤装置舞台上固定一个盘子, 并将圆顶灯放在设备上。注意: 请参阅仪表控制软件的材料表。 通过点击控制伤害装置的计算机桌面上的软件图标, 启动仪器控制软件。在 “启动” 窗口中单击它, 运行 “in_vitro_neurotrauma lvproj” 项目。从 “项目” 窗口中, 启动运动控制和位置跟踪器虚拟仪器 (motion_control), 分别通过双击它们来命名为 “position_tracker” 和 “vi”。 关闭受伤装置周围的笼子。按下运动控制 vi 左上角的 “箭头” 按钮, 运行 vi, 然后单击 “接近底部” 以将舞台降低到与平头接触的2毫米以内。单击 “停止” 按钮停止 vi。注意: 在笼子里操纵相机时, 不要把手放在担架上。笼子应该装有一个门开关, 只有当笼门关闭时, 才能向伸展装置提供电源。 在 “项目” 窗口中, 右键单击 “坐标轴 1″。单击 “交互式测试面板”。在打开的窗口中, 在 “目标位置” 字段中输入 “500” 单位, 将步骤大小设置为50µm。 重复单击 “交互式测试面板” 窗口底部的绿色 “转到” 按钮, 直到第一个板块与任何平头进行接触。检查照相机显示的实时图像上的联系人。注意在 “交互式测试面板” 窗口左上方报告的垂直阶段位置;这是第一个接触位置。 进一步降低 (如步骤3.2.6 中所述), 直到每个井都与平头接触。如有必要, 移动相机以查看整个板块并将舞台向上移动 (通过指定一个负的 “目标位置”) 和向下。注意当所有帖子都处于联系状态时, 在窗口左上方报告的垂直舞台位置 (这是完整的联系人位置)。 注意第一个触点和完全接触位置之间的区别。关闭 “交互式测试面板”。运行 ‘ 运动控制 VI ‘ (见步骤 3.2.4), 并点击 ‘ 顶部 ‘, 以提高舞台。用 “停止” 按钮停止运动控制 VI。 一旦舞台在其旅行的顶端, 打开门停用该设备。调整压块拐角处的固定螺钉。拧松第一次接触的拐角处的螺钉, 将其调低, 并拧紧相反的螺钉, 以提高触点最后的拐角。 重复降低舞台的过程, 直到板块接触平头, 检查接触图像的倾斜, 提高舞台, 并调整 (步骤 3.2.9) 压块。当舞台和块对齐时, 所有平头将立即进行接触。 打开门, 使设备停用。将螺钉插入压块上的孔中, 并拧紧。确认块与固定螺钉的位置相同 (步骤 3.2. 4-3. 2.8)。当板块接触时, 注意 “交互式测试面板” 报告的舞台位置。这将是压痕实验的零位置。 润滑平头。 如果压块刚刚被设置, 并尚未润滑, 清洁一个固体橡胶垫 (7.5 厘米 x 11 厘米 x 1.5 毫米) 和软, 封闭细胞泡沫橡胶垫 (7.5 厘米 x 11 厘米 x 3 毫米) 与乙醇浸泡实验室擦拭。让他们风干。 用玉米油浸泡一个实验室擦拭, 把它涂在固体橡胶垫上, 使其暗淡发亮。 将泡沫垫放到实心橡胶垫上, 将油转移到泡沫垫上。将7.5 厘米 x 11 厘米 x 0.5 厘米的铝板置于泡沫垫的顶部, 并将其装入大约360克的压载重量 (例如, 6 个圆锥管, 每个装有45毫升的水), 以确保一致的油从固体橡胶垫到泡沫垫。允许十年代油转移到泡沫橡胶垫。 将泡沫橡胶垫移到压阵列上。把铝板和压载重量放在上面, 以确保油的一致转移到平头的尖端。允许十年代的石油转移到平头。 如果压块第一次被设置和润滑后没有拉伸板, 则在开始实验前拉伸一个测试板。注意: 这将防止第一个拉伸和随后的伸展之间的任何不一致使实验混淆。对于后续拉伸, 重复步骤 3.3. 2-3. 3.5 在每次拉伸之前。 伸展盘子。 润滑平头, 如步骤3.3 所述。 用舞台夹具将损伤装置台上的钢板固定。如果不育是必需的, 调整盖子的位置保护板材, 不用暴露文化表面到房间空气。 使用”运动控制 VI” 将舞台下降到零位置 (见步骤 3.2. 4-3. 2.6);零位是在步骤3.2 中确定的。 将 “位置跟踪 VI” 中 “文件路径” 字段中的文件名更改为唯一文件名, 然后使用该窗口左上角的 “箭头” 按钮运行该文件名。 设置缩进的深度和持续时间 (通常为1-4 毫米和30毫秒, 分别为 “运动控制面板 VI” 中的 “伤害 (mm)” 和 “伤害持续时间” 字段中的最大深度5毫米, 最小持续时间15毫秒), 单击字段并键入所需的值。 运行 ‘ 运动控制面板 VI ‘, 并点击 ‘ 伤害 ‘ 的板缩进。 点击 “顶部” 将舞台向上移动到其行程的顶端。然后用 “停止” 按钮停止 VI, 然后打开车门来停用伤害装置。 检查 “位置跟踪器 VI” 中显示的阶段的位移历史, 以确认是否应用了指定的最大位移。右键单击图表, 然后单击 “导出到 Excel”。点击 “文件 |保存 “以保存数据”。 4. 膜拉伸特性的表征 在每个压白色的顶部画出凹槽, 为高速录像提供高对比度背景。注意: 不要把平头的轮辋漆成与盘子接触的地方。 3D. 用聚乳酸 (PLA) 印刷, 或以其他方式制造, 在每个井中制作一个圆点的圆柱形印章。使气缸直径为5.9 毫米, 高12.2 毫米, 柱面凸起1.5 毫米直径, 1.0 毫米高居中。注: 3D 可打印型号的图章。STL ‘ 可用作辅助文件。 如步骤2.1 所述, 等离子在油井中对板进行右上侧, 以激活硅酮细胞培养表面。 将盘子放在橡皮垫或其他柔软的表面上。将标记上的小凸起 (参见步骤 4.2) 与永久标记笔中的墨迹进行素数。将邮票插入井中进行测试, 并点击以确保油墨的良好传输。把邮票放在每一个井前。 对齐压块并润滑损伤装置的平头 (见步骤 3.2-3.3)。把盘子夹在受伤装置的舞台上。在损伤装置上方放置一个明亮的漫射轴向光。 在臂架上设置高速摄像头, 在受伤装置上, 正面朝下, 镜头设置为最小编号的 f 停止, 并打开它。在连接到照相机的计算机上启动照相机软件。在 “帧速率” 下拉菜单中, 选择每秒2000帧, 然后在 “快门” 下拉菜单中, 选择生成高对比度图像的最快曝光时间。中心在点缀的水井。 将相机定位在 3 x 4 网格中, 使视野中包含12口井。注意: 此视图字段为 1280 x 1024 图像提供了吞吐量和分辨率之间的最佳折衷。 将盘板降至零点 (见步骤 3.2. 4-3. 2.6)。一键单击照相机软件上的 “记录” 按钮, 使其读取”触发器”。启动位置跟踪器 VI (步骤 3.4.4)。 打开明亮的漫射轴向光。如步骤3.4.6 中所述, 缩进板。 关闭明亮的漫射轴向光。 在照相机控制计算机上, 查找在其中出现缩进的记录的30-40 毫秒窗口: 在照相机软件中拖动高速视频播放栏中的开始和结束箭头。单击 “保存”, 在 “文件名” 字段中设置名称, 在 “格式” 字段中选择 “TIFF”, 然后单击 “保存”。 看看。TIF-文件为最小拉伸 (开始) 和最拉伸 (峰值压痕) 状态的图像。 要测量两个图像中点的高度和宽度, 请使用斐济打开最小和峰值拉伸的图像。使用默认的矩形选择工具, 单击并拖动以在最小拉伸图像中的点周围绘制一个框。用 “分析 |” 测量高度和宽度措施 “。 在峰值拉伸图像的同一井中重复该点。对其余的水井重复。 计算x和y方向中的拉格朗日应变, 如下所示:注意: 在这里, Exx 是x方向的拉格朗日应变, Eyy 是y方向的拉格朗日应变, x是点的宽度, y是点的高度, f表示最终图像 (即、峰值缩进图像), i表示初始图像 (即缩进前图像)。平均两个值来确定该井中的应变。 5. 电镀培养细胞 蒸汽灭菌箱和压载重量将用于杀菌。 等离子在六十年代对硅胶底板进行右上侧处理 (见步骤 2.1)。立即将盘子浸入含有70% 乙醇的无菌箱中15分钟。 将在无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的盘子浸入30分钟。 从水井中吸出 PBS。一次只干一盘, 以防油井失去等离子处理。注意: 硅胶底板在吹打时比刚性板提供的触觉反馈更少, 而且更有可能堵塞吸管的尖端。 每井加100µL 0.1 毫克/毫升鸟氨酸 (巴解组织) 至灭菌板。室温孵育1小时。 用100µL 无菌 PBS 冲洗两次水井, 在井下进行第二次冲洗, 直到细胞悬浮液准备好。 使用安全手套和在干冰上放置 hiPSCNs 从液氮储存中取出瓶。快速运输小瓶到37°c 水浴和解冻为确切地3分钟。不要旋转瓶子。 在无菌罩中, 用1毫升的血清吸管将小瓶的内容轻轻地转移到50毫升锥形管中。 用1毫升的室温完全维护介质 (培养基 + 补充剂) 冲洗空低温瓶。 每秒大约一滴, 将1毫升的介质传输到50毫升管中。添加时, 轻轻地旋转管子。在大约2滴/秒内, 添加8毫升室温完全维护介质到50毫升管。 把管子盖上, 反转2-3 次。用 hemocytometer 计数单元格。计算将细胞悬浮液稀释到22.5万细胞/毫升所需的额外介质的体积。 用25毫升血清学吸管轻轻地将介质量 (上面计算的) 注入细胞悬浮管中。 添加10µL 1 毫克/毫升层粘连蛋白的股票每1毫升细胞悬浮与1000µL 微, 以实现10µg/毫升层粘连蛋白在细胞悬浮。吸上和下一次与使用的头层粘连蛋白, 然后盖管和反转管一次。 从盘子里吸出 PBS, 一次一盘。使用多通道吸管添加100µL 的 hiPSCN 细胞悬浮在每个井。水井的养殖面积为0.33 厘米2, 因此每个区域的细胞密度为67500个单元格/厘米2。 在室温下将盘子休息15分钟, 以促进附着。为避免无菌培养罩的风扇振动, 请将盖板放在实验室工作台上。孵化文化在37°c 与 5% CO2。 在24小时内进行全介质更改, 用200µL 完整的维护介质重填油井。每2-3 天执行100µL 的半媒体更改。 6. 伤害文化 对齐压块并找到步骤3.2 中所述的零位置。润滑平头, 如步骤3.3 所述。 在 “位置跟踪程序 VI” (步骤 3.4.4) 中设置置换历史记录的文件名。设置 “运动控制 VI” (步骤 3.4.5) 中的伤害参数。 把盘子从孵化器中弄伤, 把它夹在舞台上。调整盖子的位置, 以确保板不暴露在空气中的文化。 使用 “运动控制 VI”, 将板块降低到零点 (步骤 3.2. 4-3. 2.6)。启动 “位置跟踪器 VI” (步骤 3.4.4)。 使用运动控制 VI 缩进板 (如步骤3.4.6 中所述)。对于假伸展, 跳过这一步。 将舞台返回到其运动范围的顶端 (请参见步骤 3.4.7)。把盘子还给孵化器。 检查并保存位移跟踪 (如步骤3.4.8 中所示)。 7. 显微学 准备一个10x 染色溶液与2µg/毫升赫斯特33342和5µg/毫升 Calcein 在维护媒体。 用20µL 的10x 染色溶液染色。 孵育15分钟, 染色37摄氏度。 获取广域荧光图像。使用传统的 FITC 和 DAPI 滤波器组分别对 Calcein AM 和赫斯特33342信号进行图像处理。如果多井成像序列将需要10分钟以上, 请将该板块置于舞台顶部孵化器中, 以保持文化的健康。注: 10X, 0.30 NA 透镜提供了足够的细节, 以确定细胞的生存能力和形态学。调整增益, 以确保良好的可视化的突起, 即使这会导致一些饱和的更明亮的躯体。 在绿色 Calcein AM 通道中分割活细胞图像, 以识别躯体和突起。使用蓝色赫斯特33342通道中的核图像协助识别体细胞。