Deze methode zorgt voor de generatie van tetraploïde en Triploïde Caenorhabditis nematoden van een diploïde stam. Polyploïde stammen die zijn gegenereerd door deze methode zijn gebruikt voor het bestuderen van chromosoom interacties in Meiotische profase, en deze methode is nuttig voor de behandeling van belangrijke fundamentele vragen in de cel, ontwikkelingsstoornissen, evolutionaire, en Kankerbiologie.
Mechanismen die betrekking hebben op hele genoom polyploïdie spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling en evolutie; ook is een abnormale generatie tetraploïde cellen gekoppeld aan zowel de progressie van kanker en de ontwikkeling van resistentie. Tot nu toe, is het niet haalbaar is om de ploïdie van meercellige dieren gemakkelijk te manipuleren zonder te genereren meestal steriele nakomelingen geweest. Gepresenteerd hier is een eenvoudige en snelle protocol voor het genereren van tetraploïde Caenorhabditis elegans dieren van een diploïde stam. Deze methode kan de gebruiker een vooroordeel in chromosoom segregatie tijdens meiose, uiteindelijk verhogen ploïdie in C. elegansmaken. Deze strategie is gebaseerd op de tijdelijke vermindering van de expressie van het gen van de rec-8 voor het genereren van diploïde gameten. Een rec-8 mutant produceert diploïde gameten die potentieel tetraploids op bevruchting kunnen produceren. Deze hanteerbare regeling is gebruikt voor het genereren van tetraploïde stammen uitvoering mutaties en chromosoom herschikkingen inzicht te krijgen in de dynamiek van de chromosomale en interacties tijdens de paring en synapsis in meiose. Deze methode is efficiënt voor het genereren van stabiele tetraploïde stammen zonder genetische tellers, kan worden toegepast op elke diploïde stam, en kan worden gebruikt voor het afleiden van Triploïde C. elegans. Deze eenvoudige methode is handig voor het onderzoeken van andere fundamentele biologische vragen die relevant zijn voor de instabiliteit van het genoom, gene dosering, biologische schalen, extracellulaire signalering, aanpassing te benadrukken, ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen, en mechanismen van soortvorming.
Hele genoom polyploïdie bestaat in de gehele natuur en is vaak een noodzakelijke stap in aanpassing, speciatie organogenese, wondgenezing en biologische schalen; het is ook bekend om zowel kanker als weerstand tegen drugs1,2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. landbouw- en visserijproducten industrieën genereren polyploïde planten, vis en schaal-en schelpdieren door chemische behandeling (bijvoorbeeld, colchicine en orzalin) voor informatie sneller groeicijfers en omvangrijker gewassen en vee13, 14,15. Experimentele en inefficiënte productie van tetraploids bestaat voor de muis en de zebravis model systemen16,17. Echter, de meeste of alle polyploïde meercellige dieren gegenereerd zijn embryonically letale of steriele en dus niet ideaal voor laboratorium studies over de gevolgen van polyploïdie in een meercellig organisme. Dus, enig begrip van de hele genoom polyploidization in meercellige organismen beperkt gebleven tot nauw verwante soorten van evolutionaire recente polyploidization evenementen18,19,20 . Een pad om query’s voor de biologische rol of gevolgen van polyploidization is het gebruik van het systeem van C. elegans model. Belangrijker, C. elegans is een hanteerbare genetische systeem dat normaal gesproken bestaat als een diploïde, bevat slechts vijf autosomes (A) en één geslacht chromosoom (X) per genoom, is transparant waardoor voor in vivo observatie van biologische processen, en heeft een korte levenscyclus van 3-4 dagen (van ei tot seksueel volwassen volwassene). C. elegans is aangetoond te kunnen reproduceren als een tetraploïde, die het meest voorkomende type van hele genoom polyploïdie in de natuur is. Triploïde dieren kunnen worden gegenereerd door overschrijding van de tetraploids met ze, maar hun ploïdie is niet stabiel, en de stammen worden diploïde binnen een paar generaties.
In de afgelopen decennia slechts een handvol van levensvatbare en vruchtbare C. elegans tetraploids stammen werden geïsoleerd in het laboratorium, met behulp van een strategie die is moeizaam en genereert slechts beperkte soorten stammen21,22, 23. deze strategie genereert C. elegans tetraploids door warmte-shock behandelingen, die vermoedelijk is van invloed op chromosoom segregatie in de gameten, gevolgd door een screening voor vermeende polyploïde dieren met behulp van genetische tellers. Deze tetraploids waren uiterst nuttig bij het onderzoek van hoe deze nematode bepaalt of mannelijke of hermafrodiete te worden. Latere studies gebruikt de beschikbare spanningen te onderzoeken van de groei, gene dosis en regulering van de synapsis tijdens de meiose in deze nematode21,24,25,26. Helaas, deze studies werden beperkt door de moeilijkheid bij het genereren van nieuwe tetraploïde stammen en de achtergrond genetische tellers deze stammen bevat. Hieronder is een eenvoudige en snelle protocol voor het genereren van stabiele tetraploids, die is gebruikt voor het genereren van stammen om te bestuderen van de regulering van de synapsis tijdens de meiose27.
Net als in de natuur, kunnen polyploidization ontstaan door de vorming van diploid in plaats van haploïde geslachtscellen. Onze bevinding dat een meiose-specifieke cohesin component mutant rec-8 diploïde zaadcellen genereert en eicellen aangegeven dat neerhalend de rec-8 -gen zou leiden tot de productie van tetraploïde nakomelingen (Figuur 1)27, 28,29. Genereren van tetraploïde stammen omvat neerhalend rec-8 door RNA-interferentie (RNAi) voor twee generaties om phenocopy de rec-8 mutant diploïde gameten. Vermeende polyploids kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door hun langer dan normale lichaamsgrootte. Polyploids worden bevestigd als volledige of gedeeltelijke tetraploids door het tellen van het aantal chromosomen per kern eenmaal stabiel lijnen zijn gevestigd.
De hier beschreven strategie maakt het mogelijk de generatie van stabiele tetraploïde Caenorhabditis nematode virusstammen uit eerste diploïde genetische achtergrond of karyotype zonder het gebruik van genetische merkers. Aangezien dit protocol meer efficiënte, veelzijdige en eenvoudig dan de regeling die eerder gebruikt is, zal het zich uitbreiden de hulpmiddelen die nodig zijn om te vragen de rol van polyploidization in fundamentele processen van evolutie in meercellige, ontwikkeling en stabiliteit van het genoom genetisch gemodificeerde organismen. De enige begaanbare beperking in het gebruik van dit protocol is in genetische achtergronden resistent tegen RNAi.
Productie van haploïde geslachtscellen van (n) is de sleutel tot het genereren van een diploïde (2n) zygote op bevruchting. Deze verlaging van het genoom is bereikt tijdens de meiose met twee opeenvolgende celdelingen na een enkele genoom duplicatie. Voor het genereren van haploid gameten, C. elegans, zoals met de meeste andere metazoans, scheiden maternally – en paternally-afgeleide homologen in de eerste klasse, overwegende dat zuster chromatiden van elk homolog in de tweede divisie scheiden. Een manier die hele genoom polyploïdie ontstaat in de natuur is door middel van de generatie van de gameten, die niet de helft van hun genoom grootte tijdens de meiose.
Het is gekend voor meer dan 50 jaar dat tetraploïde C. elegans nematoden zijn levensvatbaar en vruchtbaar. Nigon23, en later Madl en Herman22, gegenereerd en een handvol C. elegans tetraploids door verstoren Meiotische chromosoom segregatie geïdentificeerd gebruik van warmte-shock behandelingen en het gebruik van genetische markers, respectievelijk. Een extra honkslag C. briggsae tetraploïde stam was afgeleid met behulp van dit protocol meer dan 30 jaar later24. Deze tetraploids werden gebruikt om te onderzoeken hoe C. elegans bepalen of mannelijke of hermafrodiete, hoe ploïdie regelt de groei en grootte, en om te analyseren in paren rangschikken en synapsis in meiose25,26,, 38 , 39 , 40. maar deze en andere studies waarbij het gebruik van specifieke tetraploids of Triploïde stammen werden beperkt door de moeilijkheid bij het genereren van tetraploïde stammen door deze methode.
Het protocol beschreven hier stelt de generatie van stabiele volledige 4A, 4 X en gedeeltelijke 4A, 3 X tetraploïde Caenorhabditis nematode stammen uit een eerste diploïde genetische achtergrond of karyotype zonder het gebruik van genetische merkers.
Tetraploidy kunnen ontstaan door meer dan één mechanisme in C. elegans:
Madl en Herman gesuggereerd dat de tetraploïde stammen die ze gegenereerd waarschijnlijk ontleend aan een Triploïde tussenfase. Hun stammen werden verkregen door selectie over meerdere generaties of door overschrijding van de vermeende Triploïde intermediair met diploïde mannetjes22. De gebreken in het chromosoom partitioneren in rec-8 mutanten dat aanleiding geeft tot diploïde eicellen en zaadcellen suggereren een ander mogelijk mechanisme waarmee tetraploïde dieren zich met de rec-8 RNAi regeling27 voordoen kunnen.
De rec-8 RNAi behandeld hermafrodieten kon produceren diploïde oöcyten en spermatocyten, die aanleiding tot tetraploïde dieren op bevruchting geven zou. Overeenstemming met deze mogelijkheid is het feit dat sommige van de gekloonde F2 hermafrodieten gaf aanleiding tot stabiele Lon stammen in de volgende generatie, die dat suggereert de gekloonde Lon F2 hermafrodieten waar al tetraploïde. In de kruising-regeling, is de eerste generatie van rec-8 RNAi behandeld hermafrodieten gekruist met onbehandelde mannen. Diploïde spermatocyten kunnen nog steeds voordoen bij mannetjes, omdat het Kruis wordt gedaan in de aanwezigheid van bacteriën uiting van rec-8 dsRNA en dus, mannetjes worden blootgesteld aan rec-8 RNAi tijdens de paring gedurende ten minste 3 dagen. De Lon polyploids in de cross-fertilizing regeling kon daarom ook hebben gevormd uit de bevruchting van eicellen diploïde door diploïde sperma. Stabiele tetraploïde spanningen kunnen ontstaan vanuit beide bevruchting tussen diploïde gameten of vanaf kruising Triploïde dieren met eicellen van variabele ploïdie met diploïde dieren haploïde sperma produceren.
Belangrijke overwegingen:
Zelf-versus kruisbestuiving regelingen:
De regeling van de zelfstandigen Bemestings- rec-8 RNAi behandeld F1 hermafrodieten en de regeling met betrekking tot de overschrijding van de behandelde hermafrodieten met onbehandelde mannetjes beide gaf aanleiding tot 4A, 4 X en 4A, 3 X tetraploïde stammen. Hoewel meer polyploids oorspronkelijk geïsoleerd van de regeling zelf waardegevende bestanddelen waren, meer van deze polyploïde dieren waren steriele en dus beide systemen zijn ook efficiënt op het produceren van tetraploïde stabiele stammen. De reden voor de toegenomen succes en steriliteit in de zelfstandige waardegevende bestanddelen regeling blijft onbekend. Hoewel beide systemen ook efficiënt zijn, is de zelfstandige waardegevende bestanddelen regeling makkelijker als het niet dat de isolatie van mannen voor de paring vereist. Bovendien, wanneer de spanning van belang is inefficiënt of defect bij de paring, zou de zelfstandige waardegevende bestanddelen regeling wenselijk zijn. De cross-fertilizing regeling mogen worden gebruikt voor het genereren van complexe tetraploids met meer dan twee versies van een één chromosoom.
Wijzigingen en beperkingen:
Momenteel, omvat dit protocol rec-8 RNAi behandeling door het voeren van de bacteriën uiten dsRNA voor de rec-8 -gen. Dus, dit protocol werkt niet in Caenorhabditis soorten niet reageert op RNAi door het eten, of in mutanten defect in milieu- of systemische verspreiding van RNAi tussen weefsels41,42,43. Dit probleem kan mogelijk worden opgelost door de invoering van RNAi behandeling door directe inspuiting van de dsRNA van belang rechtstreeks in de kiemcellen.
Triploïde dieren moeten worden gegenereerd door een tetraploïde overtocht naar een diploïde dier waarvan het afkomstig is, omdat deze regeling geen stabiele Triploïde stammen44,45 genereert. Slechts 15% van de eieren gewenste door triploids hatch, en hun nageslacht zijn meestal steriele nageslacht als gevolg van aneuploïdie. Daarnaast enkele overlevende vruchtbare nakomelingen zijn vaak volledig of in de buurt van ze binnen een paar generaties. Dit is waarschijnlijk, tenminste gedeeltelijk, omdat eicellen gedeeltelijk Trisomie corrigeren zijn door het scheiden van het derde chromosoom in het lichaam van de polar in de eerste Meiotische klasse.
Een onoverkomelijke beperking van dit protocol is dat het niet werkt voor het maken van tetraploids van mutanten die invloed hebben op onderdelen van de machine RNAi omdat ze resistent zijn tegen RNAi behandeling46.
Problemen oplossen:
REC-8 RNAi:
Een paar overwegingen zijn cruciaal voor dit protocol om succesvol te zijn. De eerste is het gebruik van verse IPTG en vers bereide IPTG NMG platen voor inductie van rec-8 dsRNA productie in de bacteriën van de bacteriën HT115 uitvoering van de kloon van rec-8 (W02A2.6). IPTG is lichtgevoelig en het is belangrijk om te verminderen blootstelling aan licht aan platen. IPTG platen kunnen maximaal één maand bij 4 ° C in het donker worden opgeslagen. Ten tweede, de rec-8 (W02A2.6) RNAi HT115 bacteriestammen uit de Ahringer-bibliotheek (Kamath en Ahringer 2003) leverde een sterkere rec-8 fenotype dan andere beschikbare rec-8 HT115 klonen.
Tetraploïde stam onderhoud:
Tetraploïde stammen groeien heel langzaam en produceren van hoogstens 50 nakomelingschap per generatie47. Alle geïdentificeerde tetraploïde stammen zijn relatief stabiel, maar ze kunnen breken en geworden diploïde wanneer benadrukt (Jonathan Hodgkin persoonlijke communicatie en onze niet-gepubliceerde opmerkingen). Daarom is het belangrijk op te merken dat wanneer tetraploïde soorten worden gekweekt bij 25 ° C, warmte-geschokt, uitgehongerd, of bevroren en ontdooide, ze snel naar de diploidy, terugkeren kunnen dus het is belangrijk te blijven halen de Lon dieren wanneer deze stammen ontdooien of wanneer bloot van deze stammen aan de stressvolle omstandigheden die kunnen veroorzaken hen om terug te keren.
Mogelijke toepassingen:
Onderzoek naar het effect of de rol van hele genoom polyploidization in evolutie, celcyclus, genuitdrukking en ontwikkeling in meercellige organismen heeft vertrouwd op vergelijkingen tussen: cellen in een organisme waarin verschillende ploïdie, dezelfde cel typen in nauw verband met verschillende ploïdie, of soorten die hebben ondergaan evolutionair recente polyploidization gebeurtenissen en fysieke isolatie3,5,6,7,8 ,11,18,19,20,48,49,50. Hoewel tetraploids kan worden afgeleid uit de zebravis en muis modelsystemen, zijn hun nageslacht steriel of embryonically dodelijke16,17. Bovendien, deze modelsystemen hebben lange levenscycli t.o.v. C. elegans, en de beschikbare methoden voor het genereren van polyploïde dieren zijn ingewikkeld en inefficiënt. C. elegans spanningen afgeleid door deze methode zal dus instrumentale voor het bevorderen van een onderzoek naar de effecten en de rollen van hele genoom polyploïdie in meercellige organismen.
Aangezien een Triploïde kan worden afgeleid uit een tetraploïde door de tetraploïde overtocht naar de oorspronkelijke diploïde, biedt een vergelijking tussen ze, triploids en tetraploids die alleen in het aantal exemplaren van het genoom verschillen, een unieke en ongekende gelegenheid om evalueren van gelijkwaardige dieren/organen/cellen met verschillende genoom grootte (of gene dosis). De flexibiliteit en het gemak van de hier beschreven regeling heeft ons voor het genereren van tientallen tetraploïde stammen van verschillende genetische diploïde achtergronden of karyotypes toegestaan. Sommige van deze stammen werden reeds gebruikt om query mechanismen voor paring van de homologe chromosoom en synapsis tijdens de meiose27.
Wild type en mutant tetraploïde stammen uitvoering van fluorescente markeringen zal bieden nieuwe mogelijkheden van onderzoek te begrijpen van relaties tussen genoom grootte en nucleaire/cytosol verhouding op intracellulaire/mobiele/orgel en hele dier schalen, hele genoom polyploidization op de aanpassing, soortvorming, gene dosis en expressie en weefsel- en orgaanbanken ontwikkeling. Naast de studie van biologische schalen zal de generatie van tetraploïde stammen verder aanzienlijk query’s voor fundamentele biologische vragen relevant zijn voor de extracellulaire signalering, instabiliteit van het genoom, endoreduplicatie, hele genoom dubbel, gene dosering, aanpassing aan stress, ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen, en mechanisme soortvorming.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Caenorhabditis genetica Center (gefinancierd door het National Institute of Health (NIH) Office van onderzoek infrastructuur programma’s P40 OD010440) voor stammen. De auteurs bedank Baptiste Roelens en Eli Lessman, voor het verstrekken van ons met constructieve feedback en de Mano-Lab op CCNY, CUNY voor het gebruik van hun laboratorium voor een deel van het filmen en voor hun hulp. Dit werk werd gesteund door een PVC-CUNY award TRADB-46-113 en NIH grant 1SC2GM118275-01. M.S. was slechts gedeeltelijk ondersteund door een Canadese Instituut van gezondheid (CIHR) postdoctoral fellowship, en E.K. werd gesteund door de NIH/NIGMS stijgen GM062981 verlenen.
Dissecting Microscope | Motic Microscopy | SMZ171 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NGM agar plates | |||
60 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3305 | |
35 mm x 15 mm Petri Dishes, Sterile | Tritech Research | T3500 | |
Bacteriological Agar, 5 kg | VWR | 89140-850 | |
Sodium Chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Peptone, BD Bacto | VWR | 90000-368 | |
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
IPTG, dioxane-free | Thermo Scientific | R0391 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Culture | |||
LB Lennox Broth | IBI Scientific | 89126-176 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LB Agar plates | |||
LB Agar Lennox | IBI Scientific | 89126-182 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibiotics | |||
Ampicillin Trihydrate | VWR | 97062-300 | |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Hoechst 33258, Pentahydrate | Biotium | 40045 | |
DAPI | Biotium | 40011 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol Fixation | |||
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP | Koptec, VWR | 89125-166 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
M9 Buffer | |||
Sodium chloride, Biotechnology Grade | VWR | 97061-278 | |
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade | VWR | 97062-346 | |
Sodium phosphate, monobasic dihydrate | Fisher Scientific | AC271750025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAi Clones | |||
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Source Bioscience | W02A2.6 | |
HT115 bacteria expressing rec-8 dsRNA | Dharmacon | RCE1182-202299820 |