Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü
Summary
Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.
Abstract
Alveoler makrofajlar ölümcül farklılaştırılmış, akciğer yerleşik makrofajlar doğum öncesi kökeni vardır. Alveoler makrofajlar onların uzun ömürlü ve akciğerleri ve işlev yanı sıra onların akciğer lokalize yanıt enfeksiyon ve inflamasyon onların önemli rol içinde benzersizdir. Bugüne kadar tanıma, yalıtım ve alveoler makrofajlar insan ve fare kullanımı birleştirilmiş yöntem bulunmaktadır. Böyle bir yöntem çalışmaları bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde yapılan çeşitli deneysel ayarları için gereklidir. Alveoler makrofajlar bronchoalveolar lavaj sıvı veya Akciğer doku hasat ve onları içinde vitrokorumak için kolayca herhangi bir laboratuvar tarafından kabul edilebilir, burada açıklanan yöntemi basitleştirilmiş bir yaklaşımdır. Alveoler makrofajlar öncelikle alveoller yapışık hücreleri olarak meydana çünkü bu yöntemin önce hasat ve kimlik kekii üzerinde odaklanmıştır. Akciğer son derece bozukluklarına bir organdır ve çeşitli hücre tiplerinin myeloid ve lenfoid kökenli yaşamak, etkileşim ve akciğer microenvironment tarafından etkilenmiştir. Burada açıklanan yüzey işaretlerinin kümesini kullanarak, araştırmacılar kolayca belirsizliğe yer bırakmadan alveoler makrofajlar diğer lökositler tanımlanması, ayrıştırılması ve onları aşağı akım uygulamalarda arındırmak. Burada geliştirilen kültür yöntemi her iki insan destekler ve alveoler makrofajlar içinde vitro büyüme için fare ve hücresel ve moleküler çalışmalar ile uyumludur.
Introduction
Akciğer microenvironment bir ayrıntılı hava kanalı ve damarlara ile benzersiz olarak karmaşık bir ekosistem var. İnhale hava nefes borusunu delip geçmiş çok sayıda şube bronchioles ve bronşlar kan-hava gaz değişimi oluştuğu alveoller ulaşmadan önce geçecek. Atmosferi ile doğrudan etkileşim nedeniyle solunum yüzey havadaki parçacıklar ve kirleticilerin zararlı etkilerinden koruma gerektirir. Fiziksel, kimyasal ve immünolojik engeller bir takım akciğer korumak. Özellikle, solunum yüzeyde fagositler dağıtımını bir önemli ilk satır savunma sistemi hizmet vermektedir. Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer yerleşik fagositler bir türdür ve akciğer makrofaj havuzu büyük çoğunluğu kadar yapıyorlar. Onların adından da anlaşılacağı gibi AMs öncelikle alveoler Lümen yerelleştirilmiştir ve sürekli ortam atmosfer örnek ve alveoler epitel1ile iletişim kuran sesil hücreler olarak ortaya çikmaktadir. Kararlı duruma akciğerlerde AMs2olan kompozisyon iltihap, enfeksiyon ya da kronik kirleticiler maruz nedeniyle değiştirebilir, alveoler uzayda fagositler % 95’den fazla vardır.
AMs geniş bir akciğerlere yerel olabilir fonksiyonların ve/veya sistemik önemli alanda katılmak. Örneğin, AMs geliştirme ve en uygun akciğerler işleyişi ve gereklidir; immün gözetim; ve hücresel enkaz patojenler ve inhale parçacıklar3,4,5,6,7istila, boşluk. AMs hedeflenen tükenmesi izni solunum virüs ve bakteri4,8zarar olduğu bilinmektedir. Fagositler ve pulmoner homeostazı ilk satır savunucuları olarak onların rol yanı sıra, AMs alabilme T antijen sunan hücreler bağışıklık9, hücre gibi çalışmaya burunici aşı10 etkinliğini potentiating bilinen ve Akciğer tarafından kısıtlanmış otoimmünite akciğer nakli11,12sonra etkileyen. Eksikliği AM işlevindeki pulmoner alveoler proteinosis (PAP), bir genetik mutasyon, malignite veya pulmoner yüzey aktif maddeleri13,14Gümrükleme bozar enfeksiyon kaynaklanan bir durum bağlı. AMs nakli şimdi PAP 15,16tedavisi için bir tedavi yaklaşımı olarak keşfedilmeden.
AMs embriyogenez sırasında kaynaklanan ve hayatı boyunca akciğerlerde lökosit2,17dolaşan tarafından değiştirilen olmadan kalıcı olması için bilinir. AM ciro homeostatik akciğerlerde tespit edilemez olmasına rağmen çeşitli düzeylerde AM ciro enfeksiyon da dahil olmak üzere bazı klinik koşullarda bildirilmiştir grip virüsü4, myeloablative ışınlama18, endotoksin maruz 19ve yaşlılık20. AMs via düşük dereceli nükleer silahların yayılmasına karşı17,21kendini yenilemek inanılıyor, ama bazı yeni çalışmalar monosit intravasküler akciğer makrofajlar22,23 altında bir nüfusa çıkmasına neden olabilir olduğunu iddia Ama bu yeni dönüştürülmüş pulmoner makrofajlar işlevselliğini deneysel koşullar henüz akciğer hastalıklarında tanımlanması gerekir. Ayrıca, AM etkinleştirme içeriğinde uyarıcı eşik anlama akciğer iltihabi sinyalleri ve immunoregulatory makine arasında bir denge korumak çalışır gibi potansiyel olarak ilginç bir alan olduğunu.
Bağışıklık yönetmelik kaybına yol fizyolojik veya patolojik değişiklikler çeşitli klinik ayarları (Örneğin, solunum yolu enfeksiyonları, inflamatuar akciğer hastalığı ve fibrotik akciğer hastalığı) değerlendirmek önemlidir. Yine de, AMs giderek göstergeleri veya hatta akciğer sağlığı11,24belirleyicileri kabul edilmektedir. Şu anda, hasat, karakterize, ve/veya bakımını AMs insanlar ve preklinik fare modelleri için kullanılabilir birleştirilmiş iletişim kuralı vardır. AM öncüleri ve fenotipleri üzerinde bir fikir birliği olmaması ve detaylı bir metodoloji yokluğu AM deşifre rolleri büyük barikat akciğer sağlığı ve hastalıkları olmuştu. Aşağıdaki iletişim kuralı kesin kimlik, yalıtım ve büyük ölçüde AM davranış anlayışı ilerletmek ve tanı ve tedavi edici çalışmalar AM hedefli kolaylaştırmak vitro kültür strateji sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
AMs doğumda başlayan ve tüm yaşam süresi26üzerinde kalıcı ciğerleri doldurmak uzun yaşam akciğer yerleşik makrofajlar vardır. Pulmoner Fizyoloji7 ve patoloji12 ve pulmoner otoimmünite24 toplam tahmin etmek için potansiyel rolleri kabul edilmiştir. AMs akciğerler11,27 ‘ uzun vadeli bir durum olduğundan ve harekete geçirmek ve bağışıklık yanıtı<…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Clare Prendergast el yazması düzenleme ile yardım için teşekkür. DKN desteklenmektedir tarafından bir araştırma Flinn Vakfı’ndan (#2095) vermek ve TM Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL056643 ve R01HL092514) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. DKN yöntemleri geliştirilmiş, çalışma tasarlanmış ve el yazması yazdı; OM hayvan çalışmaları ve klinik örnek ihale ile destekli; SB akış sitometrik çözümlemesi ve hücre sıralama ile destekli; TM çalışmalar denetimli ve el yazması inceledim.
Materials
| Non-enzymatic cell dissociating solution | Millipore-Sigma | C5789 | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 620300 | |
| 22G Catheter | Terumo Medical Products | SR-OX2225CA | |
| 4-0 Non-absorbable silk braided suture | Kent Scientific | SUT-15-2 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning | 21-031-CM | |
| Mouse Fc block | BD Biosciences | 553142 | |
| Lysis buffer (PureLink RNA Kit) | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | |
| b-Mercaptoethanol | Millipore-Sigma | M6250 | |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | 644832 | |
| Ketamine (Ketathesia) | Henry Schein | 56344 | |
| Xylazine (AnaSed) | Akorn | 139-236 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| Liberase TL | Millipore-Sigma | 5401020001 | |
| DNase I | Millipore-Sigma | AMPD1-1KT | |
| 100μm cell strainer | Corning | 352360 | |
| Human Fc block | BD Biosciences | 564220 | |
| EDTA | Corning | 46-034-CI | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| L-929 cell line | American Type Culture Collection | ATCC, CCL-1 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | |
| T25 Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific | 156367 | |
| 60 mm culture dish | Millipore-Sigma | CLS3261 | |
| 15 mL Conical tube | Corning | 352097 | |
| 50 mL Conical tube | Corning | 352098 | |
| LSRFortessa cell analyzer | BD Biosciences | 657669 | |
| FlowJo | FlowJo | v10.4 | Analysis Software |
| Anti-CD45 (Mouse) | Biolegend | 147709 | Clone I3/2.3, FITC conjugated |
| Anti-CD11b (Mouse) | Biolegend | 101228 | Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated |
| Anti-CD11c (Mouse) | BD Biosciences | 565452 | Clone N418, BV 421 conjugated |
| Anti-I-Ab (Mouse) | Biolegend | 116420 | Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-Siglec-F (Mouse) | BD Biosciences | 562757 | Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated |
| Anti-Siglec-H (Mouse) | Biolegend | 129605 | Clone 551, PE conjugated |
| Anti-F4/80 (Mouse) | Biolegend | 123118 | Clone BM8, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-Ly-6C (Mouse) | Biolegend | 128035 | Clone HK1.4, BV605 conjugated |
| Anti-CD64 (Mouse) | Biolegend | 139311 | Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated |
| Anti-CD24 (Mouse) | BD Biosciences | 563115 | Clone M1/69, BV510 conjugated |
| Anti-CD103 (Mouse) | BD Biosciences | 745305 | Clone OX-62, BV650 conjugated |
| Anti-CD317 (Mouse) | Biolegend | 127015 | Clone 927, APC conjugated |
| Anti-CXCR1 (Mouse) | Biolegend | 149029 | Clone SA011F11, BV785 conjugated |
| Anti-CD45 (Human) | Biolegend | 304017 | Clone HI30, AF488 conjugated |
| Anti-CD11b (Human) | Biolegend | 101216 | Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated |
| Anti-HLA-DR (Human) | Biolegend | 307618 | Clone L243, APC/Cy7 conjugated |
| Anti-CD169 (Human) | Biolegend | 346008 | Clone 7-239, APC conjugated |
| Anti-CD206 (Human) | Biolegend | 321106 | Clone 15-2, PE conjugated |
| Anti-CD163 (Human) | Biolegend | 333612 | Clone GHI/61, BV421 conjugated |
Referenzen
- Westphalen, K., et al. Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity. Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells. PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).
- Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections. J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).
- MacLean, J. A., et al. Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity. Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).
- Nakamura, T., et al. Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung. J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).
- Schneider, C., et al. Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection. PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).
- Pribul, P. K., et al. Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development. J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).
- Macdonald, D. C., et al. Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease. Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).
- Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV). Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).
- Nayak, D. K., et al. Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses. Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).
- Sekine, Y., et al. Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation. J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).
- Borie, R., et al. Pulmonary alveolar proteinosis. Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).
- Greenhill, S. R., Kotton, D. N. Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction. Chest. 136 (2), 571-577 (2009).
- Happle, C., et al. Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).
- Suzuki, T., et al. Pulmonary macrophage transplantation therapy. Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).
- Hashimoto, D., et al. Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes. Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).
- Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. The prolonged life-span of alveolar macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).
- Maus, U. A., et al. Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).
- Perdiguero, G. E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung. J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. J Exp Med. , (2017).
- Zheng, Z., et al. Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction. Sci Transl Med. 9 (394), (2017).
- Nayak, D. K., et al. Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection. Sci Transl Med. 9 (398), (2017).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
- Eguiluz-Gracia, I., et al. Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients. Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).
- Yu, Y. A., et al. Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
