Подготовка мышиных подчелюстной слюнной железы вертикально прижизненной микроскопии
Summary
Мы описываем протокол к хирургическим путем предоставления и стабилизировать мышиных подчелюстной слюнной железы для прижизненной визуализации с помощью вертикально прижизненной микроскопии. Этот протокол является легко адаптируется к другим экзокринных желез головы и шеи региона мышей и других мелких грызунов.
Abstract
Подчелюстной слюнной железы (SMG) является одним из трех основных слюнных желез и представляет интерес для многих различных областях биологических исследований, включая клеточной биологии, онкология, стоматологии и иммунологии. SMG-это экзокринной железы состоит из секреторных клеток эпителия, миофибробласты, эндотелиальные клетки, нервы и внеклеточного матрикса. Динамических клеточных процессов в крысы и мыши SMG ранее были образы, главным образом с использованием инвертированный микроскоп мульти Фотон систем. Здесь мы опишем простой протокол для хирургической подготовки и стабилизации мышиных SMG наркотизированных мышей для изображений в vivo с вертикально мульти Фотон Микроскоп систем. Мы представляем наборы представитель прижизненные изображения эндогенных и восприимчивую переведены люминесцентные клеток, включая маркировки кровеносных сосудов или Слюнных протоков и второй гармоники поколения визуализировать фибриллярного коллагена. В целом наши протокол позволяет для хирургической подготовки мыши слюнных желез в вертикальном микроскопии системах, которые обычно используются для прижизненной визуализации в области иммунологии.
Introduction
Слюна выделяется экзокринных желез для смазывания пищи, защиты слизистой поверхности устным тракт и доставить пищеварительные ферменты, а также противомикробные вещества1,2. Помимо незначительных слюнных желез перемежаются в устной подслизистой есть три двусторонние набора основных желез, определены как околоушной, сублингвальном и подчелюстные, согласно их местоположение1,2. Пирамидальная эпителиальных клеток, организовал в колбе образный мешки (ацинусов) или demilunes, которые окружены миоэпителиальных клеток и базальной мембраны, выделяют серозной и слизистой оболочки компонентов слюны1. Узкие Люминал пространство Ацинусы стекает в вставными воздуховодов, которые объединяются в полосатый воздуховодов до тех пор, пока они наконец объединить в единый воздуховода выделительную1. Основные выделительной протока SMG называется Wharton протока (WD) и открывает в сублингвального Мясца3,4. Эпителиальный отсеке SMG поэтому представляет структуру высоко arborized с коллектора терминала конечными точками, напоминающие пучок виноград1,5,6. SMG интерстиция состоит из кровеносных и лимфатических сосудов, встроенных в соединительной ткани7 , содержащий парасимпатические нервы8 и5внеклеточного матрикса. Нормальные человеческие и грызунов слюнных желез также содержат T клетки, макрофаги и дендритные клетки9, а также клетки плазмы, которые выделяют иммуноглобулина (IgA) в слюне9,10. Благодаря своей многогранной функции в здоровье и болезни SMG является предметом интереса для многих областях биологических исследований, включая стоматологии4, иммунология11, онкология12, физиологии8и клеточной биологии 3.
Визуализации динамических клеточных процессов и взаимодействий является мощным инструментом в биологических исследований13,14. Разработка глубоких тканей изображений и инновации inmicroscopes на основе нелинейной оптики (НЛО), которые полагаются на рассеяния или поглощение нескольких фотонов в образце, позволила непосредственно изучить клеточных процессов в сложных тканей13 ,15. Поглощения фотонов несколько включает поставку энергии общего возбуждения, низкой энергии фотонов, который ограничивает Флюорофор возбуждения в фокальной плоскости и таким образом позволяет более глубокого проникновения в ткани с сокращением фотоповреждения и шум из фокус возбуждения13,15. Этот принцип работает в двух Фотон микроскопии (2 PM) и позволяет для изображения флуоресцентных образцов в глубинах до 1 мм15,16. Во время коммерчески доступных 2 PM, установок стали удобным и надежным серьезной проблемой для прижизненной визуализации является тщательно подвергать и стабилизировать органа-мишени наркотизированных мышей, особенно для изображений серии промежуток времени. Несколько методов для коррекции цифровых дрейф после сбора данных были опубликованы18 17,и мы недавно разработали «VivoFollow», систему автоматической коррекции, которая противодействует медленно ткани дрейф в реальном времени с помощью Компьютеризированная этап19. Однако все еще важно для высокого качества изображений для сведения к минимуму движения ткани, особенно быстрые движения, вызванные дыхание и сердцебиение19. Подготовка и стабилизации процедуры были опубликованы несколько органов, включая спинного20, печени21, кожи22,23легких и лимфатических узлов24. Кроме того модели для визуализации слюнной железы крыс были развитыми3,25 и доработаны для прижизненной визуализации высокого разрешения Мурина, которую SMG с учетом инвертированным микроскопом установки26, 27 , 28.
Здесь мы представляем практической и гибкой протокол для прижизненной визуализации мышиных SMG с помощью вертикально нелинейных микроскопии, который обычно используется для прижизненной визуализации в области иммунологии. С этой целью мы изменили широко занятых иммобилизации стадии используется для подготовки подколенной лимфатических узлов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предоставляет простой подход для обработки изображений в vivo мышиных сублингвального и подчелюстных слюнных желез, с помощью вертикально-нелинейная микроскопии, часто используется в области иммунологии. Метод может быть адаптирована для отображения других экзокри?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась швейцарского национального фонда (СНФ) проект Грант 31003A_135649, 31003A_153457 и 31003A_172994 (для СП) и Леопольдина стипендии 2011 ЛПДС-16 (BS). Эта работа, выиграли от оптических установок «микроскопия Imaging центр» (MIC) Бернского университета.
Materials
| Narketan 10 % (Ketamine) 20ml (100 mg/ml) | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml) | Bayer | 680538150144 | |
| Saline NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml) | Fatro | 6805671900029 | |
| Electric shaver | Wahl | 9818L | or similar |
| Hair removal cream | Veet | 4002448090656 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m) | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| Super glue Ultra gel, instantaneous glue | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| Grease for laboratories 60 g glisseal N | Borer (VWR supplier) | DECO514215.00-CA15 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | or similar |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | or similar |
| Cotton swab | Migros | 617027988254 | or similar |
| Gauze Gazin 5 x 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | or similar |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 | or similar |
| Texas Red dextran 70kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| Cascade Blue dextran 10kDa | invitrogen | D1976 | |
| Two-photon system | LaVision Biotec | TrimScope I and II | or similar |
| XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective | Olympus | n/a | or other water immersion objective |
| Digital thermometer | Fluke | 95969077651 |
Referenzen
- Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. Digestive System. Digital Histology. , 101-121 (2005).
- Carpenter, G. Role of Saliva in the Oral Processing of Food. Food Oral Processing. , 45-60 (2012).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).
- Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands. Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).
- Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development. Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).
- Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland. Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).
- Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. Expression of podoplanin in the mouse salivary glands. Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).
- Proctor, G. B., Carpenter, G. H. Regulation of salivary gland function by autonomic nerves. Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).
- Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands. Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).
- Hofmann, M., Pircher, H. E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands. Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).
- Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice. J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).
- Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors. PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
- Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. Intravital microscopy. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 µm in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).
- Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments. Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).
- Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 8, 406 (2017).
- Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), e52607 (2015).
- Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis. J Vis Exp. (109), e53585 (2016).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).
- Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. J Vis Exp. (60), e3720 (2012).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).
- Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins. J Vis Exp. (79), e50558 (2013).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).
- Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals. J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).
- Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton’s duct. J Vis Exp. (51), e3074 (2011).
- Chen, G. Y., Nuñez, G. Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage. Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).
- McLaren, A. Some causes of variation of body temperature in mice. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).
- Baumgart, K., Wagner, F., Gröger, M., et al. Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice. Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).
- Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperth. , 1-13 (2017).
- Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells. Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).
- Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).
- Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).
- Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice. J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).
- Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).
- Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging. Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).
- Potma, E. O., Xie, X. S. Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).
