포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

1. 주 1: 세포 배양 원하는 금액에 분석할 셀 문화. 세포 배양 조건 및 미디어 조사 셀 형식에 따라 달라 집니다.참고: 원칙적으로, 모든 진 핵 세포는 의무가 넘어갈 여 chromatin 접근성의 분석. 이 실험에 대 한 4 x 106 HEK 293T 세포는 10% (v/v) FBS와 1% (w/v) 페니실린/스, 보충 하 고 5% CO2 와 셀 70-80%의 합류를 도달할 때까지 24 시간 동안 37 ° C에서 incubated DMEM 매체에 단일 10 cm 접시에 시드 (~ 8 x 10 6 셀 접시 당)입니다. 2. 주 2: 포름알데히드 가교와 셀 수확 주의: 포름알데히드는 매우 독성이 고 증기 두건에서 항상 사용 해야 합니다. 착용 보호 옷 (장갑 및 실험실 외 투). 폐기물을 적절 하 게 삭제 합니다. 1% (v/v) (세포 배양 매체의 10 mL을 37% (v/v) 포름알데히드의 270 µ L)의 최종 농도 도달 하는 증기 두건에서 세포 배양 매체에 직접 포 름 알 데히드를 추가 합니다. 실내 온도 (20-25 ° C)에서 10 분 동안 incubate 고 슬루 판 수동으로 모든 2 분.참고: 가교 시간 셀 형식을 조정할 수 있습니다. 셀 라인의 대부분에 대 한 가교의 10 분의 적절 한입니다. 조직에 대 한 더 이상 외피 수 있도록 모든 셀의 고정 해야 수 있습니다. 해소는 포 름 알 데히드 0.125 M의 최종 농도에 글리신을 추가 (문화 매체의 10 mL를 2.5 M 글리신 주식 500 µ L 추가). 실 온에서 5 분 동안 incubate 고 슬루 마다 2 분. 3 세포를 씻어 얼음 차가운 PBS와 x (8 g/L NaCl, KCl, 1.44 g/L Na2HPO4 · 2 H2O, 0.24 g/L KH2포4, 0.2 g/L 조정 7.4 HCl 이나 NaOH를 pH). 매체를 발음 하 고 PBS의 10 mL를 추가 하 여 셀 문화 접시 또는 플라스 크에 직접 씻어. 두 번 느슨하게 부착 세포 HEK 293T 같은 경우 매우 조심 하 고이 단계를 반복 합니다. 추가 PBS 신중 하 게 접시의 측면에는 세포의 분리를 피하기 위하여. 3 세척 후 1 ml의 얼음 차가운 PBS와 얼음에 1.5 mL 반응 관에 셀 resuspend. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 필요한 경우 셀을 분리.참고: 시작할 때 제한 된 소재, 손실을 방지 하기 위해 샘플 절차 동안 낮은 DNA 바인딩 튜브를 사용 합니다. 300 x g 냉각된 탁상 원심 분리기에 4 ° c에서 5 분 동안 원심 분리기. 신중 하 게 그것을 발음으로 상쾌한을 삭제 합니다. 3. 세포 세포의 용 해 및 Chromatin 조각화 1 mL 랑 세포의 용 해 버퍼 (1% (w/v), 10 mM EDTA, 50 mM Tris HCl pH 8.1, 10 µ g/mL leupeptin, 10 µ g/mL aprotinin, 2 밀리미터 PMSF)에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 신중 하 게 여러 번 위아래로 pipetting으로 셀을 resuspend. 얼음에 20 분 동안 품 어. 필요한 경우이 단계에서-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 가교 된 200-300 bp의 평균 크기를 기울이려면 DNA sonicate sonicator의 특정 설정은 사용된 쥡니다 장치와 샘플의 각 소스에 대 한 결정 되어야 합니다. 어떤 경우에 DNA 전단 효율적으로 보장 합니다. DNA 전단에 대 한 최적화 단계 단계 5.14 설명 되어 있습니다. 샘플의 난방을 피하기 위해 쥡니다 동안 얼음에 샘플을 냉각 한다. 15 분 및 4 ° c.에 13000 x g에 대 한 샘플을 원심 새로운 반응 관에는 상쾌한을 전송. 100 µ L aliquots에서 샘플을 분할. 필요한 경우-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.참고: 프로토콜이 시점에서 중단 될 수 있습니다. 4입니다. 제어 DNA의 드 가교 Aliquot 단계 3.4는 crosslink 반대 하 고 총 DNA에 대 한 참조로 사용할 수에서 100 µ L을 가져가 라. RNase A (10 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 10 µ L의 성분 K (20 mg/mL)를 추가 합니다. 프로그래밍 가능 온도-블록을 사용 하 여 37 ° C에서 4 시간 그리고 6 h 65 ° C 단백질을 쪼개 고 리버스는 crosslinks에서 품 어. 마지막으로, 샘플 4 ° C에서 프로토콜 다시 시작할 때까지 누른 다음 5 단계로 진행 합니다.참고: 다른 시 키 프로토콜 참조, 따라서 데 가교11에 대 한 필요성을 폐지로 가교 화 되지 않은 세포에서 chromatin 샘플을 사용 합니다. 이러한 샘플은 하지 쥡니다 효율 또는 DNA 안정성 가교 된 차이 이어질 수 있는 사실은, 따라서 총 DNA 참조 샘플을 받은 테스트 샘플으로 동일한 절차를 사용 하 여 더 정확 하 게 이다. 5. 주 3: 페 놀: 클로 프롬 정화 DNA의 3.4 단계에서 aliquot는 비-드-가교 된 가져가 라. RNase A (10 mg/mL)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 비 데 가교 된 aliquot 양식 단계 5.1와 드-가교 된 샘플 단계 4.2에서에서 하 고 동시에 진행. H2O 도달 300 µ L의 최종 볼륨을 추가 합니다. 증기 두건 및 소용돌이에서 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (25:24:1)의 300 µ L를 적극적으로 추가 합니다.주의: 페 놀 부식성 이며 독성이 고 연기 후드를 항상 사용 해야 합니다. (장갑 및 실험실 코트) 보호 옷을 입고, 반응 관 긴밀 하 게 폐쇄 하 고 폐기물을 적절 하 게 처분. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기 신중 하 게 새로운 반응 관에 위 수성 단계의 280 µ L를 전송. Interphase는 또한 단백질을 포함에서 어떤 파편 든 지를 취할 수 없어 있는지 확인 합니다. 유기 용 매 폐기물로 나머지 낮은 단계를 삭제 합니다. 5.3-5.5 단계를 반복 하 고 신중 하 게 새로운 반응 관을 위 수성 단계의 270 µ L를 전송. 증기 두건 및 소용돌이에서 클로 프롬의 270 µ L를 적극적으로 추가 합니다.참고:이 단계는 샘플에서 모든 나머지 페 놀을 제거 하는 데 사용 됩니다. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기 신중 하 게는 interphase에에서 어떤 파편 든 지를 수행 하지 않도록 주의 복용 새로운 반응 관을 위 수성 단계의 250 µ L를 전송 합니다. 유기 용 매 폐기물로 나머지 샘플을 삭제 합니다. 5 M NaCl의 25 µ L 소 프로 파 놀의 250 µ L를 추가 합니다. DNA 운반대로 글 리 코겐 (20 mg/mL)의 5 µ L를 추가 합니다. 튜브를 거꾸로 하 여 잘 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. DNA를 침전 하 4 ° C에서 13000 x g에서 10 분 원심 분리기. 70% (v/v) 에탄올의 400 µ L로 DNA 펠 릿을 세척. 4 ° c.에 13000 x g에서 10 분 원심 분리기 상쾌한을 신중 하 게 발음 하 고 펠 릿 실 온에서 10 분 동안 건조 하자. 100 µ L TE 버퍼 (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA)에 resuspend. 간 DNA crosslinks 제거를 65 ℃에서 4 h에 대 한 비 데 가교 화 무료 DNA 샘플을 품 어. -20 ° c.에 샘플 저장 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 양을 계량 하 고 2% (w/v) agarose 젤에 조각 크기를 확인 하는 약 수를 실행 합니다. 전단 시간과 농도 조정할 agarose는 DNA 크기 분석의 결과 따라 젤 전기 이동 법, 200-300 bp의 평균 크기를 얻을. 6. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 무료 대 총 DNA의 결정 (다음 무료 DNA 라고 합니다)에 nucleosome 무료 DNA의 비율 대 총 DNA qRT-PCR17,18에 의해 결정 됩니다. 샘플은 microarray 교 잡 또는 게놈 넓은 결정을 위한 깊은 시퀀싱에 의해 양이 많게 분석 수 있습니다 또한. 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 및 테스트 영역에 대 한 정량 Pcr 뇌관 디자인.참고: 적합 한 긍정적인 컨트롤은 ACTB, GAPDH, TPI1, TUBA1A 등 적극적으로 베낀된 하우스키핑 유전자의 발기인에 뇌관 (β-말라, GAPDH, TPI 또는 α-Tubulin 인코딩). 적절 한 부정적인 컨트롤 섬으로 지역 또는 유전자 사막에서 발견 된다. 게놈 지역 조사 로컬 복사본 번호 차이 (표 1)에 대 한 제어를 동적으로 레 귤 레이트 된 소재 시에 인접 한 다른 적합 한 부정적인 컨트롤을 디자인할 수 있습니다. TE 버퍼 10 ng / µ L의 최종 농도에 DNA 샘플을 희석 하 고 최종 계산에 대 한 계정에 희석 요인 (단계 6.5 참조). 다음 반응 믹스 잘 당 96 잘 접시에 triplicates에서 정량 반응 설정: 템플릿 DNA: 20 (2 µ L), 앞으로 뇌관 200 nM (5 µ M 주식의 0.4 µ L), 역방향 뇌관 200 nM (5 µ M 주식의 0.4 µ L) 녹색 염료 (2 배 재고에서 5 µ L), 및 H2O 10 µ L를 포함 하는 반응 혼합을 사용 하 여 상업적인 준비. 절대 부 량 모드를 사용 하 여 실시간 정량 Pcr 장치에서 실행 하 고 다른 뇌관 쌍으로 샘플의 Ct를 결정. 단계 6.3에서에서 희석 요인 고려 하는 다음 수식을 사용 하 여 각 뇌관에 대 한 총 DNA에 무료 한 DNA의 회복의 비율을 계산:대표 결과 예제 계산 표 2에 제공 됩니다. 샘플 간의 차이 대 한 보상, 긍정적인 통제 복구 비율에 정상화: