생성 및 복잡 한 Karyotypes 셀 세포 주기 검거의 절연

문화 조건 RPE 1 hTERT 셀 라인은 매체에 있는 Dulbecco의 수정이 글 (자료 테이블) 10% 보충 교양 소 태아 혈 청, 2 m L-글루타민, m 그리고 100 U/ml 페니실린/스. 셀 5% CO2 습도 환경에서 37 ° C에서 incubated 했다. 10 cm 요리를 사용 하 여 개발 되었습니다 아래에 설명 된 프로토콜을 모든 기술적인 세부 사항 보고 그 요리를 합니다. 다른 요리를 사용 하는 경우 확장 또는 그에 따라 아래로. 1입니다. RPE-1 셀의 동기화 모든 실험에 대 한 15 개 이상의 구절 하지 받은 갓 해 동된 셀을 사용 합니다. 1 일에 해 동 하 고 분배 ~2.5-10 cm 조직 문화 접시에 105 RPE 1 hTERT 셀 x 5.0. 표준 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 밤새 품 어. (예: hemocytometer) 표준 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다.참고: 셀 밀도 RPE-1 세포의 성장 상태를 말합니다. 성장 조건이 다른 셀 라인; 사이에서 다를 수 있습니다. 그에 따라 그들을 조정 하십시오. 하루에 2, g 1/S 테두리에서 셀 일반 성장 매체를 발음 5mm 티 미 딘을 포함 하는 8 mL 매체를 추가 하 여 동기화 합니다.참고: 티 미 딘 농도 치료의 길이 다른 세포 라인에 걸쳐 달라질 수 있습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최상의 조건을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 당일 3, 티 미 딘 매체 (1.2 단계)를 추가한 후 24 h, 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS로 세포 세척 하 여 티 미 딘 블록에서 놓습니다. 일반 성장 매체의 8 mL을 추가 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 2.이 세대 Mitotic 키 Mps1의 활동을 방해 하 여 세포 에 티 미 딘 블록에서 하루 3, 출시 후 6 h (1.3; 단계 세포 유사 분열을 입력 하기 전에이 약 3-6 h는), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 500 nM reversine (Mps1 억제제)를 포함 하는 매체를 바꿉니다.참고: RPE-1 세포는 유사 분열 9-12 h를 입력 후에 티 미 딘 워시 아웃10,11. 그러나, 세포 주기 론 다른 셀 라인 마다 다릅니다. 따라서, 그것은 (예를 들어, 콘텐츠를 통해 FACS DNA 분석 측정 하 여) 설립된 방법으로 세포 주기 분석을 수행 하 여 파일럿 실험에서 그 속도 결정 하는 중요 한. 또한, Mps1 억제제의 최적의 작업 농도 세포 사이 달라질 수 있습니다. 이전 실험 RPE1 셀을 사용 하 여 reversine를 사용 하 여 500 nM10,,1112의 작업 집중에 성공 했습니다. 그것은 셀 라인 테스트를 위한 최적의 농도 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 하루에 4, reversine 처리 (후 세포 유사 분열에 약 6 h) 후 12 h, reversine 매체를 발음 하 고 세 번 1 x PBS 가진 세포를 씻어. 접시에 8 mL 일반 성장 매체를 추가 하 고 인큐베이터에 셀을 반환 합니다. 3. Aneuploid 자전거 셀 및 ArCK 인구의 농축 제거 하루 6, 셀 입력 첫 번째 유사 분열 후 약 72 h에 (2.2; 단계 약 66 h reversine 워시 아웃 후, 해당 약 하는 이것이 2-3 세포 주기), 중간 발음, 1 x PBS로 한번 세척 하 고 300 nM nocodazole를 포함 하는 매체를 바꿉니다.참고: 최근 작품 aneuploid karyotypes를 은닉 하는 RPE-1 셀 genomically 불안정 하 고 그들의 확산에 대 한 체포를 보이고 있다 2-3 세포 주기 후 첫 번째 잘못 된 유사 분열10. 그러나,이 활동은 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 그것은 aneuploid 순환 세포의 제거를 위한 적절 한 타이밍을 결정 하기 위해 파일럿 실험을 수행 하는 중요 한입니다. 하루 7, nocodazole 처리 후 12 h 매체를 발음 하 고 플레이트 1 x PBS의 3 개 mL를 추가 합니다. 접시의 측면을 눌러 mitotic 세포를 흔들어. Mitotic 세포도 제거를 허용 하도록 각 탭 사이의 접시를 회전 합니다. Mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해, 여러 라운드 (3-5 회 권장), 발음 및 각 라운드 사이 1 x PBS의 3 mL를 추가 쉐이크-오프 프로세스를 반복 합니다. 쉐이크-오프, 부드럽게 액체는 뚜껑이 나 접시의 가장자리에 고착 하는 발음. 간단히, 10 배 확대에 현미경 플레이트를 확인 하십시오. 몇 mitotic 세포 관찰 된다 확인 합니다. 5 개 이상의 mitotic 세포 10 X 목표 아래 볼 수 있습니다, 쉐이크-오프의 또 다른 라운드를 반복 합니다.참고: Mitotic 세포는 둥근 나타나고 쉐이크-오프 후 부분적으로 분리 될 수 있습니다. 그것은 nocodazole 치료의 다음 라운드에 세포를 노출 하기 전에 mitotic 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 중요 합니다. 이렇게 하지 않으면 mitotic 세포 죽음으로 이어질 및 tetraploid 세포의 생성 될 수 있습니다. 마지막 악수-오프 후, 셀 1 x PBS의 5 mL로 한 번 씻는 다. 8 mL 매체 330 nM nocodazole를 포함 하는 접시에 추가 하 고 12 h에 품 어. 아니 mitotic 세포 배양 후 관찰 하는 때까지 모든 12 h nocodazole 치료/동요-오프 (3.1-3.5 단계) 반복 합니다. 일반적으로, 치료/동요-오프의 4-5 라운드는 것이 좋습니다.참고: 여기에 제공 된 정보는 RPE-1 셀에 참조 하십시오. 치료/동요-오프 라운드의 수는 다른 세포 사이에서 달라질 수 있습니다. Nocodazole 연장 하 고 불필요 한 노출을 피하기 위해 신중 하 게 결정, 파일럿 실험에서 aneuploid 자전거 셀의 효율적이 고 완전 한 제거에 필요한 라운드 수에 결정적 이다. 4-5 라운드 후의 nocodazole 치료/쉐이크-(3.1-3.6 단계), 일반 성장 매체의 10 mL을 추가 하 고 품 어. 세포 조작 또는 분석 결과 장차 전에 12-24 h 동안 휴식을 하실 수 있습니다.참고: 마지막 악수-오프 후, 접시에 남은 세포 세포 주기 검거 그리고, 같이 최근10, 항구의 복잡 한 karyotypes. 이 세포를 ArCK (복잡 한 Karyotype와 체포) 세포 라고 합니다. 그것은 격리 1 주일 이내 ArCK 인구에 분석 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 필요에 따라 복잡 한 karyotypes 체포 셀의 비율을 평가 하기 위해 수집 하 고 각 쉐이크-오프 표준 셀 카운터를 사용 하 여에서 셀 키를 누릅니다. 그림 1: 생성 하 고 복잡 한 karyotype (ArCK)와 대표 이미지 aneuploid 세포를 분리 하는 데 사용 하는 방법의 전체 회로도. (A) 회로도의 ArCK 세포 생성 및 격리 프로토콜. (B) RPE 1 hTERT 세포 치료의 각 단계에서의 대표 이미지. 마지막 패널 (빨간색으로 설명 된) 격리 ArCK 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 4입니다. ArCK 인구의 특성 다음 분석을 수행 하 여 ArCK 인구의 성공적인 분리를 확인 합니다. 엉덩이 베타-galactosidase 얼룩 (노화의 마커)를 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 키트 (재료의 표 참조). 상용 장비 (재료의 표 참조)를 채용 하 여 CCL2, 같은 프로 염증 성 cytokines의 분 비를 측정 합니다. 세포 주기 억제제 p53, p21, 서쪽 오 점, p16의 증가 수준을 확인 합니다.참고: 이러한 분석을 제대로 제어 하려면 ArCK 인구는 euploid와 aneuploid 자전거 셀에 비교할 수 한다. 전자는 낮은 통로, 야생-타입 RPE 1 hTERT 기 하 급수적으로 성장 하는 세포. 후자의 RPE 1 hTERT에 염색체 미 분리를 유도 하 고 수확 하는 첫 번째 탈 선 유사 분열 후 세포 72 h에 의해 얻어질 수 있다. 이렇게 하려면 단계 1.1 수확 셀 및 첫 번째 nocodazole 치료 (3.1 단계) 앞에서 설명한 프로토콜을 따릅니다. 체포 셀의 karyotype를 평가 하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 수행 합니다.참고: 단일 셀 연속13단일 셀 수준 셀 인구에서 염색체 및 하위 염색체 변화를 확인 하려면 잘 설립 방법 이다. 단일 셀 시퀀싱을 수행 하는 방법에 대 한 자세한 절차 다른10을찾을 수 있습니다.