جيل وعزل الخلايا القبض على دورة الخلية مع كاريوتيبيس المعقدة
Summary
انيوبلويدي يؤدي إلى عدم الاستقرار الجينوم، التي تنتج في النهاية القبض على دورة الخلية خلايا مع كاريوتيبيس المعقدة. تقدم هذه الورقة طريقة بسيطة وملائمة لعزل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي تتوقف على تقسيم.
Abstract
كروموسوم سوء العزل يؤدي إلى انيوبلويدي، شرط فيها خلايا إيواء عدد الكروموسومات غير متوازن. خطوط العديد من الأدلة تشير بقوة إلى أن انيوبلويدي مشغلات الجينوم عدم الاستقرار، وتوليد الخلايا مع كاريوتيبيس المعقدة التي وقف انتشار هذه الأسلحة في نهاية المطاف. عزل وتوصيف الخلايا التي تأوي كاريوتيبيس معقدة ذات أهمية حاسمة لدراسة أثر عدد الكروموسومات غير متوازن في فيزيولوجيا الخلية. وحتى الآن، تم إنشاء أية أساليب موثوق بها عزل هذه الخلايا أنيوبلويد. تقدم هذه الورقة وضع بروتوكول لتخصيب اليورانيوم وتحليل الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة التي تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة القياسية، وغير مكلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل العديد من الميزات من الخلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة، بما في ذلك النمط الظاهري المستحث الافرازية المرتبطة بالشيخوخة، وممتلكاتهم برو التحريضية، والقدرة على التفاعل مع الخلايا المناعية. لأن الخلايا السرطانية غالباً ما تأوي الاختلالات في عدد الكروموسوم، من الأهمية بمكان فك كيفية تأثير انيوبلويدي فسيولوجيا الخلية في الخلايا الطبيعية، مع الهدف النهائي المتمثل في الكشف عن كلا توموريجينيك برو ومكافحة إثارة.
Introduction
أخطاء عملية العزل الصبغي يؤدي إلى انيوبلويدي، شرط تتميز بعدد الكروموسومات التي ليست متعددة لتكملة فرداني1،2،،من34. أنيوبلويد كاريوتيبيس مشغل النسخ المتماثل للتأكيد على أن يولد مزيدا من عدم الاستقرار المجيني5،6،،من78،،من910، يزيد تناذر التعقيد، وفي نهاية المطاف يؤدي إلى دورة الخلية اعتقال يتدنى من الخلايا10. وغرض الطريقة المعروضة هنا هو توليد وفصل هذه يتدنى من ركوب الدراجات الخلايا. عن طريق استخدام تقنيات زراعة الأنسجة غير مكلفة، يسهل هذا البروتوكول إلى العزلة وتوصيف للقبض على دورة الخلية خلايا أنيوبلويد مع كاريوتيبيس المعقدة. هذه الخلايا هي المشار إليها كخلايا أركك (توقيف مع تناذر معقدة) ونظرائهم ركوب يوبلويد كعناصر تحكم.
هذا البروتوكول هو الأول الذي سينشأ لهذا الغرض ويسمح بالعزل ودراسة المزيد من خطوط أركك بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على، فعل الشيخوخة والمرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري (ساسب)، على برو-التهابات ميزات، وقدرتها على التعامل مع الخلايا المناعية. الطريقة المعروضة هنا قد وضعت في الخلايا البشرية تناظري، مخلدة ولكن لم يتم اختباره في خطوط السرطان بعد. قد تكون بعض الخلايا المحولة غير مبال بدوره الخلية اعتقال بسبب قمع مسارات واحدة أو متعددة؛ ولذلك، ينبغي إجراء التحقق من الصحة كذلك في خطوط الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح هذا الأسلوب رواية لتوليد وإثراء للخلايا المقبوض عليهم مع مجمع كاريوتيبيس (أركك) لدراسة الخلايا التي لديها كروموسوم المكاسب أو الخسائر متعددة، والكف عن تقسيم. قد تم تصميم إعداد أسلوب لتسهيل عزل خلايا أركك بطريقة سريعة وموثوق بها.
أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا التحليل هو السيطرة صرامة الجدول الزمني للعلاج من تعاطي المخدرات، والأهم من ذلك، إزالة الخلايا ركوب أنيوبلويد. لتحقيق أفضل النتائج، توقيت العلاج نوكودازولي ويهز قبالة أهمية خاصة لضمان إزالة الخلايا الدراجات من اللوحة في حين أنها لا تزال مقربة والانقسامية، منع احتمال موت الخلية الانقسامية أو انزلاق إلى G1، يحتمل أن تكون تهيئة عدد سكان تيترابلويد. من غير المستحسن أن توقيت هزة قبالة ينحرف أكثر من ساعتين من حضانة الموصى به 12-ح نوكودازولي.
الدراسات المستقبلية في أركك الخلايا لديها القدرة على تيسير فهم أعمق لكيفية كاريوتيبيس معقدة تؤثر على فيزيولوجيا الخلية. على وجه الخصوص، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا أن خلايا الجهاز المناعي قادراً على التفاعل مع وإزالة المشغل محصنة من أركك الخلايا10. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر نقطة انطلاق ممتازة لتوصيف المزيد من الخلايا أركك، بما في ذلك توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إزالة المناعي في الخلايا تناظري ودراسة كيفية النمطان التحول وقد تجاوز هذا إليه المراقبة، مسألة جوهرية في الحقل14،15.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل جزئيا بدعم معهد كوخ (الأساسية) 14051 P30-CA منحة من المعهد الوطني للسرطان، “الوطنية للمعاهد منحة الصحة” (CA206157-22 و GM118066) و “صندوق أبحاث السرطان الرخام كيرت” لآمون انجيليكا. آمون انجيليكا أيضا محقق من معهد هوارد هيوز الطبي ومؤسسة جلين “البحوث الطبية الحيوية”. وكان تأييد س. س. الأمريكية الإيطالية السرطان مؤسسة (ع)، بزمالة في “أبحاث السرطان” من ماري كوري الإجراءات والرابطة الإيطالية لأبحاث السرطان (التحكيمية)، و “زمالة أبحاث السرطان كل خمس سنوات كي”. وأيد م زمالة من معهد هوارد هيوز الطبي.
Materials
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
| Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
| Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
| Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
| Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
| Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |
Referenzen
- Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
- Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
- Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
- Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
- Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754 (2016).
- Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
- Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).
- Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
- Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
- Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!. Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).
