Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper
Summary
Die genaue Identifizierung der satellitenzellen ist wichtig für das Studium ihrer Aufgaben unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur satellitenzellen auf Erwachsene Skelettmuskulatur Abschnitte durch Immunfluoreszenz-basierte Färbung zu erkennen.
Abstract
Immunfluoreszenz ist eine wirkungsvolle Methode, die hilft, um verschiedene Zelltypen auf Gewebeschnitte zu identifizieren. Um die gewünschte Zellpopulation zu studieren, werden Antikörper für bestimmte Zelle Marker auf Gewebeschnitte angewendet. In der Erwachsenen Skelettmuskulatur sind satellitenzellen (SCs) Stammzellen, die zur Muskel-Reparatur und Regeneration beitragen. Daher ist es wichtig, zu visualisieren und die Satelliten-Zell-Population unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu verfolgen. Im ruhenden Skelettmuskel, wohnen SCs zwischen der Basallamina und Myofiber Plasmamembran. Ein häufig verwendeter Marker zur Identifizierung von SCs auf der Myofibers oder in der Zellkultur ist das gepaarte Box Protein Pax7. In diesem Artikel wird eine optimierte Pax7 Immunfluoreszenz Protokoll auf skelettartigen Muskel Abschnitten dargestellt, die unspezifische Färbung und Hintergrund minimiert. Ein weiterer Antikörper, die ein Protein (Laminin) von der Basallamina erkennt wurde auch hinzugefügt auch zur Identifizierung von SCs. ähnlich wie Protokolle verwendet werden können, durchführen, doppelte oder dreifache Beschriftung mit Pax7 und Antikörpern für zusätzliche Proteine des Interesses.
Introduction
Skelettmuskulatur ist bestehend aus mehrkernigen Muskelzellen, genannt Myotubes, in Myofibers, die Kraft und Bewegungen durch Kontraktion erzeugen organisiert. Die Skelettmuskeln, außer für einige kraniofazialen Muskeln stammen aus embryonalen Provisorium ein Somiten1genannt. Myogen Vorläuferzellen delaminieren von epithelialen Somiten zu Myoblasten. Myoblasten weiter differenzieren in Myozyten, die Sicherung, Myotubes, Multi-kernhaltigen Myofibers bilden werden. Das obige Verfahren wird Myogenesis genannt und zeichnet sich durch zeitlich geregelt Kontrolle der Genexpression. Myogen Vorstufen express Pax3 und Pax7, während Myoblasten MyoD Express und/oder Myf5 und Myozyten Myogenin und Myosins2,3 Express. Muskel-Wachstum ist ein Prozess, in dem Myofibers durch den Einbau von mehr Myonuclei in bestehenden Fasern (Hyperplasie) und durch eine Zunahme der Muskelfaser Größe (Hypertrophie)4größer geworden. Während das Muskelwachstum ist eine nachhaltige Energiequelle myogen Zellen, die Stammzell-Eigenschaften haben, dass sie differenzieren können und selbst zu erneuern. Diese Zellen werden anhand ihrer physischen Lage zwischen dem Sarkolemm (Zellmembran der Myofiber) und der Basallamina5Satelliten-Zellen bezeichnet. SCs kräftig dazu beitragen, Muskel-Wachstum in der juvenilen Phase (die ersten 2-3 Wochen postnatale Mäuse), aber Ruhestrom im ruhenden Erwachsenen Muskel6geworden. Bemerkenswert ist, können sie reaktiviert in Reaktion auf Muskel werden verletzt und in die neue Muskelzellen zu reparieren die beschädigten Muskeln7zu unterscheiden.
Die Stammzelle Eigenschaften machen das Studium der SCs für grundlegende Muskel Biologie und Therapien von Muskel-Krankheiten-8. Infolgedessen ist es eine Fläche von intensiver Untersuchung in den letzten Jahrzehnten gewesen. Eine enorme Fortschritte erzielt in sezieren die Genetik und Epigenetik SCs9,10. Techniken, die Isolierung und Identifizierung von SCs in Situ beteiligt waren entwickelt und optimiert entlang dem Weg11. Immunofluorescent Färbung ermöglicht die Identifikation von SCs durch den Einsatz von spezifischen Antikörpern, auch bei Pax7. Die Knappheit und die geringe Größe des SCs kombiniert mit einem starken Auto-Fluoreszenz von Erwachsenen skelettmuskelgewebe rendern die Visualisierung jedoch herausfordernd. Hier beschreiben wir eine immunofluorescent staining Protokoll optimiert für Maus Muskelgewebe für Pax7 und basierend auf einer vorhandenen Methode für Zebrafisch Muskel12. Darüber hinaus wird ein Laminin-Antikörper mit einer deutlichen Fluorophor beschriftet eingesetzt, um die Basallamina zu identifizieren, unter denen die SCs befinden. Dieses Protokoll ermöglicht konsequent die Visualisierung von Pax7-Positive SCs und myogen Vorstufen unter physiologischen Bedingungen alles geprüft und Entwicklungsstadien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll stützte sich auf eine Methode der Pax7/MF20 Färbung am Zebrafisch Skelettmuskulatur12. Die Lösungen verwendet und blockieren Schritte sind identisch oder ähnlich. Die verwendeten Antikörper sind identisch. Die bereinigte Schritte basieren auf Funktionen der Maus Muskelgewebe und SCs. Erstens wurde Laminin-Antikörper hinzugefügt, in der Mischung zu helfen, zu visualisieren und bestätigen die Position des SCs. Es war besonders hilfreich, um die Anzahl der SCs unter dem Mi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei den NIAMS Imaging Lichtschnitt für die Bereitstellung der Mikroskope und technische Hilfe. Die MF20 und Pax7 Antikörper wurden von der Entwicklungsbiologie Studien Hybridoma Bank unter der Schirmherrschaft der NICHD entwickelt und verwaltet von der Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City erhalten. Diese Arbeit wurde von den intramuralen Forschung Programm des NIAMS von den National Institutes of Health unterstützt.
Materials
| methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | |
| 10x PBS | Gibco, Themo Fisher | 70011-044 | |
| 16% PFA | TED PELLA | 50-00-0 | |
| Triton-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 0 1-6201 | |
| AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. | 115-007-003 | |
| 20x Citrate Buffer | Thermo Fisher | 00 500 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Laminin polyclonal rabbit antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-21121 | |
| Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher | A-21242 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher | A32732 | |
| Leica CM1860 cryostat | |||
| Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope | |||
| Leica DMR wide-field fluorescent microscope | |||
| Zeiss LSM510 confocal microscope | |||
| Zeiss LSM780 confocal microscope | |||
| Cuisinart electronic pressure cooker |
Referenzen
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