Eine Methode zur Messung der Speicheldrüse Funktion bei Mäusen
Summary
Speicheldrüse Unterfunktion ist eine häufige Folge von Autoimmun-Krankheit und Strahlentherapie. Reproduzierbare Beurteilung der Speicheldrüse Funktion in Mausmodellen dieser Krankheiten ist eine technische Herausforderung. Hier ist eine einfache Methode für die genaue und reproduzierbare Messung der Speichelproduktion bei Mäusen beschrieben.
Abstract
Patienten mit Sjögren Syndrom, eine Autoimmunerkrankung, die Auswirkungen auf die therapeutisches Drüsen, Entzündung der Speicheldrüse zu entwickeln und Speichelproduktion reduziert haben. Ebenso ist Speichelproduktion bei Patienten, die Strahlentherapie bei Kopf-Hals-Tumoren stark beeinträchtigt. Nager-Modelle entwickelt, um diese Krankheitsbilder imitieren ein Verständnis der Pathogenese der Krankheit erleichtern und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien ermöglichen. Daher ist die Fähigkeit, präzise, reproduzierbar und wiederholt Speicheldrüse Funktion in Tiermodellen messen entscheidend. Aufbauend auf den bisher in der Literatur beschriebenen Verfahren, wurde eine Methode entwickelt, die diese Kriterien erfüllt und wurde verwendet, um die Speicheldrüse Funktion bei Mäusen zu bewerten. Ein weiterer Vorteil dieser neuen Methode ist, dass es problemlos gemeistert und wenig Inter-Operator-Variation hat. Speicheldrüse Funktion wird als die Menge (Gewicht oder Volumen) oder die Rate (mL/min) in Reaktion auf die Pilocarpin Stimulation produziert Speichel ausgewertet. Die gesammelten Speichel ist eine gute Quelle für die Analysen der Eiweißgehalt, Immunglobulin-Konzentrationen und andere Biomoleküle.
Introduction
Die Speicheldrüsen produzieren Speichel in Reaktion auf eine Vielzahl von neurologischen und mechanische Reize1. Die Reize werden durch die sympathischen und parasympathischen Nervensystem an die adrenergen und cholinergen Rezeptoren in der Drüse durchgeführt. Pilocarpin ist ein cholinergen, Para-Sympathomimetikum, das überwiegend auf Muskarin-Rezeptoren wirkt. In der Speicheldrüse induziert es die Produktion von Speichel durch Einwirkung auf die Muskarin Acetylcholin-Rezeptor M31. Speichelproduktion nach Pilocarpin Gabe ist ein Indikator für die Fähigkeit der Speicheldrüsen, auf Reize reagieren und wird allgemein als ein Maß für die Speicheldrüse Funktion verwendet.
Genaue Messung der Speichelproduktion ist entscheidend für das Studium der Speicheldrüse Krankheiten einschließlich Sjögren Syndrom2 und Strahlung Verletzung nach Kopf und Nacken Krebs Behandlung3. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um die Speichelproduktion bei Nagetieren zu messen. Dazu gehören direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Ausführungsgang4, die Sammlung von Speichel aus der Mundhöhle unter Vakuum5und Inkasso mit Glas Kapillaren6 oder einer Mikropipette7,8, 9. direkte Kanülierung der Speicheldrüsen Rohrleitung bietet am meisten präzise und reine Speichel. Aber dies ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren und das Potenzial für Umstehende Duktales schließt sich wiederholende Speichel Sammlungen vom selben Tier. Sammeln von Speichel unter Vakuum führen zu unterschiedliche Ergebnisse durch Trocknung des Speichels aus dem Rohr. Dieser Verlust ist bei Mäusen mit reduzierter Speichelfluss weiter übertrieben. Glaskapillaren erlauben die Sammlung des Speichels für spätere Analysen, Veränderungen in der Viskosität des Speichels abgesondert im kranken Zustand verhindert jedoch, dass effiziente Füllung der Kapillare. Darüber hinaus können Versuche die Mundhöhle residual Speichel sammeln zu fegen zu Verletzungen führen. Pipettieren Methode ermöglicht die komplette Sammlung, und für den gleichen Betreiber ist es bemerkenswert konsistent zwischen Experimente. Aus unbekannten Gründen zeigt diese Methode jedoch erhebliche Unterschiede zwischen verschiedenen Betreibern. Daher um entsprechende Vergleiche zu ermöglichen, ist es zwingend notwendig, dass die gleiche Betreiber alle Experimente, die im Zusammenhang mit einem bestimmten Projekt führt. Natürlich ist dies einen großen Nachteil für ein Labor.
Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein Verfahren entwickelt, dass verbindet Speichel Erhebungsmethoden für Menschen und Nagern verwendet. Die unten beschriebene, für Pilocarpin induzierten Speichel Messvolumen Tupfer-Methode ist einfach, reproduzierbar und nicht beeinflusst durch den Betreiber und immer wieder in das gleiche Tier durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ermöglicht es den Speichel für spätere Analysen von Proteinen, Immunglobuline oder andere Biomoleküle zu sammeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Speichelproduktion ist ein komplexer Prozess und wird durch viele Faktoren beeinflusst. Daher kann die Messfunktion Speicheldrüse bei Versuchstieren eine Herausforderung sein. Eine zusätzliche Herausforderung ist, dass wiederholte Messungen der Speicheldrüse Funktion im gleichen Tier erforderlich, um den Ausbruch der Krankheit zu etablieren oder zur Erholung nach der Behandlung zeigen.
In diesem Bericht beschriebenen Tupfer-Methode ist technisch einfach mit mehreren Optionen zur Darstellung…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde unterstützt durch ein Stipendium der National Institutes of Health, National Institut of Dental und Craniofacial Forschung (DE025030).
Materials
| Chemicals for saliva collection | |||
| Pilocarpine hydrochloride | Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA | B21410 | Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Mix solution | Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months. | ||
| Zetamine (Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | Stock is 100 mg/mL |
| Anased (Xylazine) | Med-Vet International, Mettawa, IL, USA | RXANASED-20 | Stock is 20 mg/mL |
| Isotonic sterile saline | Vet One, Boise, Idaho, USA | 501032 | Used as diluent |
| Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment) | Henry Schien, Dublin, OH, USA | 48272 | Used to prevent eyes from drying during the procedure |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for saliva collection | |||
| SalivaBio Children's swab | Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA | N/A | Individually wrapped swabs |
| 50 mL polypropylene tubes | VWR, Radnor, PA, USA | 89004-364 | Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth. |
| Microcentrifuge tubes 0.6 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-290 | Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | VWR, Radnor, PA, USA | 87003-298 | |
| Insulin Syringes with permanently attached needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 324702 | |
| 18 gauge regular bevel needles | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 305195 | |
| Sterile scalpel blade #11 | Integra York Inc PA, USA | 4-311 | |
| Microdissecting forceps | Roboz, Gaithersburg, MD, USA | RS-5139 | Serrated angular 0.8 mm tip, 4" length |
| Label tape | Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA | sc-224487 | |
| 3 channel timer | Amazon.com, Seattle, WA, USA | B06W2KCYVN | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo, Columbus OH, USA | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction | |||
| LPS | Invivogen, San Deigo, CA, USA | tlrl-b5lps | Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL – inject 100 uL/ moue ip |
| Imject Alum adjuvant | Thermo Scientific | 77161 | Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse |
| Rabbit anti-Ro52 antiserum | Generated in lab | Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/ Kits for saliva analyses | |||
| Salivary lysozyme estimation | |||
| EnzChek Lysozyme Assay Kit | Molecular Probes, Eugene, OR, USA | E-22013 | Used as per manufacturer's instructions |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary IgA estimation by sandwich ELISA | |||
| Mouse IgA | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 0106-01 | Standards for sandwich ELISA – range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL |
| Goat anti- mouse IgA unlabeled | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-01 | Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer |
| Goat anti- mouse IgA HRP | Southern Biotech, Birmingham, AL, USA | 1040-05 | Detection antibody used at 1:4000 dilution |
| TMB substrate | Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA | 555214 | Used as per manufacturer's instructions |
| Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates | Thermo Scientific, Rochester, NY, USA | 3855 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salivary protein estimation | |||
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | BioRad, Hercules, CA, USA | 5000006 | For protein estimation as per manufacturer's instructions |
Referenzen
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren’s syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren’s syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren’s syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren’s syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
