Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas
Summary
O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.
Abstract
A capacidade de diferenciar as células-tronco humanas pluripotentes induzidas (iPSCs) em hepatócitos células (HLCs) oferece novas oportunidades para estudar erros inatos do metabolismo hepático. No entanto, para fornecer uma plataforma que ofereça suporte a identificação de pequenas moléculas que potencialmente pode ser usado para tratar a doença do fígado, o procedimento requer um formato de cultura que é compatível com milhares de compostos de triagem. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando as condições de cultura completamente definidos, que permitem a diferenciação pode ser reproduzida de iPSCs humana de hepatócitos células em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Nós também fornecemos um exemplo de uso da plataforma para compostos de tela para a sua capacidade para reduzir a apolipoproteína B (APOB) produzido a partir de hepatócitos iPSC-derivados gerados a partir de um paciente de hipercolesterolemia familiar. A disponibilidade de uma plataforma que é compatível com a descoberta de medicamentos deve permitir que os investigadores a identificar novas terapêuticas para doenças que afetam o fígado.
Introduction
Sucesso na identificação de drogas que podem ser usadas para uma doença rara de destino baseia-se no desenvolvimento de ensaios que podem ser usados para a seleção. Hipótese ou telas no destino (farmacologia inversa) são úteis, mas exigem um conhecimento detalhado da base molecular da doença. Telas fenotípicas (farmacologia clássica) evitam a necessidade de uma compreensão detalhada das vias bioquímicas, mas em vez disso, contam com o desenvolvimento de modelos que espelham com precisão a fisiopatologia da doença. Apesar do entusiasmo para abordagens baseadas em alvo, análises do FDA aprovado primeiro na sua classe de drogas revelam que telas fenotípicas foram muito mais bem sucedido1. O objectivo geral deste método é estabelecer uma plataforma para alto throughput screening que pode ser usado para identificar moléculas pequenas para o tratamento da doença hepática metabólica. Vários modelos de em vitro têm sido descritos incluindo primários hepatócitos, células de hepatoma e de células progenitoras fígado2. No entanto, a maioria destes modelos têm limitações, e há uma necessidade de novos modelos com precisão pode recapitular a fisiopatologia das deficiências hepáticas metabólicas na cultura. Recentemente, as células-tronco pluripotentes humanas combinadas com a edição de gene ter oferecido uma oportunidade para modelar até os mais raros de doenças raras em cultura sem a necessidade de acesso pacientes diretamente3. Enquanto o uso de iPSCs paciente específico como uma ferramenta para descobrir pequenas moléculas para o tratamento de doenças raras do fígado é conceitualmente razoável, existem apenas alguns relatórios demonstrando a viabilidade desta abordagem4. No entanto, nós temos estabelecido recentemente uma plataforma que costumava iPSC-derivado de hepatócitos com sucesso identificar drogas que podem ser realocadas para o tratamento das deficiências no metabolismo do fígado5.
Este protocolo explica o processo de diferenciação humana iPSCs para hepatócitos células em placas de 96 poços e usá-los para selecionar uma biblioteca de pequenas moléculas. Ele também descreve a análise de ponto de extremidade usando hipercolesterolemia como um exemplo de doença hepática metabólica. Esta abordagem deve ser útil para estudar o papel e a aplicação de pequenas moléculas no contexto de doenças infecciosas do fígado, doença hepática metabólica, toxicidade de drogas e outros distúrbios hepáticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alvo baseado descoberta de drogas, onde as moléculas pequenas são identificadas que influenciam a atividade de uma proteína específica, tem sido o foco de muitos esforços de rastreio existentes. Embora essa abordagem forneceu inúmeros produtos farmacêuticos, telas com base em reverter um fenótipo, farmacologia clássica, têm sido mais bem sucedidos na identificação de compostos de primeira classe que foram clinicamente eficaz1. Uma desvantagem para descoberta de drogas fenotípica é qu…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 e HG006398 de S.A.D.). Gostaríamos de agradecer o Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop e Jing Ran pelas suas contribuições.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
Referenzen
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
