Menschen mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten-ähnliche Zellen für die Wirkstoffforschung
Summary
Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt eine Plattform zur Identifizierung von kleiner Molekülen für die Behandlung von Lebererkrankungen. Eine schrittweise Beschreibung präsentiert Details wie iPSCs in Zellen mit Hepatozyten Eigenschaften in 96-Well Platten zu differenzieren und die Zellen verwenden, um Bildschirm für kleine Moleküle mit möglichen therapeutischen Tätigkeit.
Abstract
Die Fähigkeit, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in Hepatozyten-ähnliche Zellen (GLT) differenzieren bietet neue Möglichkeiten, angeborene Fehler bei der hepatischen Metabolismus zu studieren. Das Verfahren erfordert jedoch um eine Plattform zu bieten, die die Identifikation von kleinen Molekülen unterstützt, die potenziell zur Behandlung von Erkrankungen der Leber, eine Kultur-Format, die kompatibel mit screening-Tausende von Verbindungen ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit vollständig definierten Kulturbedingungen, wodurch die reproduzierbare Differenzierung der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well-Zellkultur-Platten. Wir bieten auch ein Beispiel für die Nutzung der Plattform zu Bildschirm-Verbindungen für ihre Fähigkeit, Apolipoprotein B (APOB) senken aus iPSC-abgeleitete Hepatozyten erzeugt eine familiäre Hypercholesterinämie Patienten hergestellt. Die Verfügbarkeit einer Plattform, die kompatibel mit Wirkstoffforschung sollte erlauben Forschern, neuen Therapeutika für Krankheiten zu identifizieren, die die Leber betreffen.
Introduction
Erfolg bei der Identifizierung von Medikamenten, die verwendet werden, um eine seltene Krankheit gezielt stützt sich auf die Entwicklung von Assays, die für das Screening verwendet werden können. Hypothese oder zielbasierte Bildschirme (umgekehrte Pharmakologie) sind nützlich, aber erfordern ein detailliertes Verständnis der molekularen Grundlagen der Krankheit. Phänotypische Bildschirme (klassische Pharmakologie) vermeiden die Notwendigkeit für ein detailliertes Verständnis der biochemischen Bahnen, aber stattdessen verlassen Sie sich auf die Entwicklung von Modellen, die genau die Pathophysiologie der Erkrankung widerspiegeln. Trotz Begeisterung für Ziel-basierte Ansätze zeigen Analysen der FDA-Zulassung in erstklassige Medikamente, dass phänotypischen Bildschirme weitaus erfolgreicher1gewesen sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist eine Plattform für Hochdurchsatz-screening, die verwendet werden können, um kleine Moleküle für die Behandlung der metabolischen Lebererkrankungen zu identifizieren. Mehrere in-vitro- Modelle wurden einschließlich primäre Hepatozyten, Hepatom Zellen und Leber Progenitor Zellen2beschrieben. Jedoch die meisten dieser Modelle haben Einschränkungen, und besteht ein Bedarf für neue Modelle, die genau die Pathophysiologie des metabolischen Leber Mängel in der Kultur rekapitulieren kann. Vor kurzem haben menschliche pluripotente Stammzellen kombiniert mit dem Bearbeiten von Gen bot Gelegenheit, sogar die seltensten der seltenen Krankheiten in der Kultur ohne die Notwendigkeit, Patienten Zugang zu modellieren direkt3. Während der Einsatz von patientenspezifischen iPSCs wie ein Werkzeug, um kleine Moleküle für die Behandlung von seltenen Erkrankungen der Leber entdecken konzeptionell angemessen ist, gibt es nur wenige Berichte zeigen die Machbarkeit dieses Ansatzes4. Allerdings haben wir vor kurzem eine Plattform geschaffen, mit denen iPSC-abgeleitete Hepatozyten um erfolgreich Medikamente zu identifizieren, die für die Behandlung von Mängeln im LEBERSTOFFWECHSEL5verwendet werden können.
Dieses Protokoll erklärt den Prozess der menschlichen iPSCs Hepatozyten-ähnlichen Zellen in 96-Well Platten zu unterscheiden und mit ihnen eine Bibliothek mit kleinen Molekülen auf den Bildschirm. Es beschreibt auch die Endpunktanalyse mit Hypercholesterinämie als Beispiel für metabolische Lebererkrankungen. Dieser Ansatz sollte zur Untersuchung der Rolle und der Anwendung von kleinen Molekülen im Rahmen der infektiöse Lebererkrankungen, metabolische Lebererkrankungen, medikamententoxizität und anderen Lebererkrankungen nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ziel basiert Arzneimittelforschung, wo kleine Moleküle identifiziert werden, die Einfluss auf die Aktivität eines bestimmten Proteins, wurde der Fokus vieler bestehende Screening-Bemühungen. Obwohl dieser Ansatz hat zahlreiche Arzneimittel, basierend auf Umkehr ein Phänotyp, klassischen Pharmakologie, Bildschirme zur Verfügung gestellt wurden erfolgreicher bei der Identifizierung von First-in-Class-Verbindungen, die klinisch wirksame1gewesen sein. Ein Nachteil phänotypischen Arzneimittelfors…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (DK55743, DK087377, DK102716 und HG006398, S.A.D) unterstützt. Wir möchte Dr. Behshad Pournasr, Dr. James Heslop und Ran Jing für ihre Beiträge danken.
Materials
| 100 mm x 20 mm sterile tissue culture dishes | Corning | 430167 | |
| 100 mm x 20 mm sterile suspension culture dishes | Corning | 430591 | |
| 96-wells tissue culture plate | Corning | 3595 | |
| Anti-human Albumin | Dako | A 0001 | |
| Anti-human FOXA2(6C12) | Novus Biological | H00003170-M12 | |
| Anti-human HNF4 alpha | Santa Cruz | SC-6556 | |
| Anti-human Oct-3/4 antibody | Santa Cruz | SC-9081 | |
| Anti-human SOX17 | R&D | AF1924 | |
| Anti-human TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Activin A Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9563 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Invitrogen | 0050129SA | |
| B-27 Supplement, serum free | Invitrogen | 17504044 | |
| BMP4 Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC9533 | |
| Cell Dissociation Reagent StemPro Accutase | Invitrogen | A1110501 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | 7572 | |
| DPBS+(calcium, magnesium) | Invitrogen | 14040-133 | |
| DPBS-(no calcium, no magnesium) | Invitrogen | 14190-144 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Invitrogen | 11330057 | |
| ELISA human APOB ELISA development kit | Mabtech | 3715-1H-20 | |
| Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) | Invitrogen | PHG0023 | |
| Hepatocyte Culture Medium (HCM Bullet Kit) | Lonza | CC-3198 | |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Invitrogen | PHC0321 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Invitrogen | 11140076 | |
| Oncostatin M (OSM) Recombinant Human Protein | Invitrogen | PHC5015 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| Feeder free pluripotent stem cell medium: mTesR1 | STEMCELL technologies | 5850 | |
| Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413301 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Invitrogen | 22400105 | |
| StemAdhere Defined Matrix for hPSC (E-cad-Fc) | Primorigen Biosciences | S2071 | |
| TMB-ELISA Substrate Solution | Thermo Scientific | 34022 | |
| Anti-TRA-1-60 FITC conjugated | Millipore | FCMAB115F | |
| Versene (EDTA) 0.02% | Lonza | 17-711E | |
| Y-27632 ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 |
Referenzen
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered?. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Zeilinger, K., Freyer, N., Damm, G., Seehofer, D., Knospel, F. Cell sources for in vitro human liver cell culture models. Exp Biol Med (Maywood. 241 (15), 1684-1698 (2016).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Cayo, M. A., et al. A Drug Screen using Human iPSC-Derived Hepatocyte-like Cells Reveals Cardiac Glycosides as a Potential Treatment for Hypercholesterolemia. Cell Stem Cell. 20 (4), 478-489 (2017).
- Nagaoka, M., et al. E-cadherin-coated plates maintain pluripotent ES cells without colony formation. PLoS One. 1, e15 (2006).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Cayo, M. A., et al. JD induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes faithfully recapitulate the pathophysiology of familial hypercholesterolemia. Hepatology. 56 (6), 2163-2171 (2012).
- DeSilva, B., et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 20 (11), 1885-1900 (2003).
- Rowland, T. J., et al. Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin. Stem Cells Dev. 19 (8), 1231-1240 (2010).
- Nagaoka, M., Si-Tayeb, K., Akaike, T., Duncan, S. A. Culture of human pluripotent stem cells using completely defined conditions on a recombinant E-cadherin substratum. BMC Dev Biol. 10, 60 (2010).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells. 26 (4), 894-902 (2008).
- Mallanna, S. K., Cayo, M. A., Twaroski, K., Gundry, R. L., Duncan, S. A. Mapping the Cell-Surface N-Glycoproteome of Human Hepatocytes Reveals Markers for Selecting a Homogeneous Population of iPSC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 7 (3), 543-556 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J Biomol Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Lorenz, C., et al. Human iPSC-Derived Neural Progenitors Are an Effective Drug Discovery Model for Neurological mtDNA Disorders. Cell Stem Cell. 20 (5), 659-674 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17 (8), 971-983 (2015).
- Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (8), 853-861 (2015).
- Sampaziotis, F., et al. Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation. Nat Biotechnol. 33 (8), 845-852 (2015).
- Mallanna, S. K., Duncan, S. A. Differentiation of hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 26 (Unit 1G 4), (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res. 19 (11), 1233-1242 (2009).
- Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Pashos, E. E., et al. Diverse Population Cohorts of hiPSCs and Derived Hepatocyte-like Cells Reveal Functional Genetic Variation at Blood Lipid-Associated Loci. Cell Stem Cell. 20 (4), 558-570 (2017).
- Davidson, M. D., Ware, B. R., Khetani, S. R. Stem cell-derived liver cells for drug testing and disease modeling. Discov Med. 19 (106), 349-358 (2015).
- Choi, S. M., et al. Efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patient-specific stem cells. Hepatology. 57 (6), 2458-2468 (2013).
- Tafaleng, E. N., et al. Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from alpha1-antitrypsin deficiency. Hepatology. 62 (1), 147-157 (2015).
- Jing, R., Duncan, C. B., Duncan, S. A. A small-molecule screen reveals that HSP90beta promotes the conversion of induced pluripotent stem cell-derived endoderm to a hepatic fate and regulates HNF4A turnover. Development. 144 (10), 1764-1774 (2017).
