Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l’agente causativo di dermatosi da criptococco^{1,2, 3}. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia^4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di tubercolosi ogni anno e più ogni mese rispetto a qualsiasi epidemia di Ebola su record¹. La via più comune di esposizione si verifica da inalazione di spore essiccate che sono molto comuni in ambiente⁷. Entrando i polmoni, ci sono diversi fattori di virulenza che contribuiscono al successo di c. neoformans in individui infettati. Capsula del polisaccaride è considerata fattore di virulenza primaria di microbo, come acapsular ceppi non sono virulenti⁸.

Capsula da criptococco si compone di tre componenti principali: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteine (MPs)⁹. Mentre i parlamentari sono una componente relativamente minore parete cellulare-collegata della capsula, sono immunogenici e può favorire una risposta pro-infiammatoria principalmente^9,10. Al contrario, GXM e GalXM compongono la massa della capsula (> 90% in peso) e hanno effetti immunosopressivi¹¹. Oltre ai suoi effetti immunomodulatori, l’ingrandimento veloce della capsula in vivo crea una barriera meccanica ad ingestione di host cellule fagocitiche (cioè, neutrofili e macrofagi)¹². La capsula di c. neoformans e sua sintesi sono complessi, ma nel complesso, aumentato diametro capsula è correlato con una maggiore virulenza^6,13,14. Detto questo, è importante per i ricercatori di c. neoformans essere in grado di quantificare rapidamente e con precisione misurazioni capsule.

Sia la cella di c. neoformans e sua capsula polisaccaridica sono strutture dinamiche e mostrano cambiamenti nel tempo di¹⁵. La capsula può cambiare in Assemblea in risposta ai cambiamenti nell’host ambiente^16,17,18, dimensioni e densità. Basso contenuto di ferro o livelli di nutrienti, l’esposizione del siero, il pH fisiologico umano e aumentata di CO₂ sono noti per avviare la crescita capsula^16,18,19,20. Ulteriormente, i ricercatori hanno dimostrato cambiamenti strutturali con conseguente differenze significative in immunoreactivity durante un’infezione, un vantaggio di c. neoformans rispetto suo ospite di prestito^21,22. Questo è noto perché l’architettura della capsula c. neoformans è stato analizzato in una varietà di modi. La microscopia elettronica, ad esempio, ha rivelato che la capsula ha una matrice eterogenea con uno strato interno di elettrone-densi sotto un strato esterno, più permeabile²³. Dispersione della luce e l’uso di pinzette ottiche hanno permesso che i ricercatori più ulteriormente per delucidare sue strutture macromolecolari²⁴. Analizzando i risultati da entrambe misure di dispersione della luce statica e dinamica, sappiamo che la capsula del polisaccaride ha una complessa struttura ramificazione²³. Pinzette ottiche sono state utilizzate per testare la rigidità della struttura, nonché a valutare la reattività dell’anticorpo²⁴. Tuttavia, di gran lunga il più delle volte autonomo analisi della capsula c. neoformans è la misurazione delle sue dimensioni.

Per quantificare la capsula dimensione, i ricercatori usano quello che dovrebbe essere una semplice misurazione: il diametro lineare della capsula. Microscopi digitali vengono utilizzati per catturare immagini di celle multiple di c. neoformans (generalmente centinaia) macchiati con l’inchiostro di India o tinture fluorescenti. La dimensione di ogni corpo cellulare e capsula circostante è misurata. I dati vengono compilati e il diametro medio della capsula è calcolato sottraendo il diametro del corpo cellulare dal diametro a cellula intera (corpo cellulare + capsule). Fino a questo punto, queste misurazioni sono state fatte manualmente. Mentre in genere preciso, questo metodo ha svantaggi per i ricercatori. Grandi insiemi di dati può richiedere giorni o anche settimane per analizzare a mano. E poiché queste misurazioni vengono effettuate manualmente, soggettività e l’errore umano può influenzare il risultato.

Analisi automatizzata delle immagini computazionale sono diventato uno strumento indispensabile per i ricercatori in molti settori della biologia cellulare molecolare, consentendo l’analisi più veloce e più affidabile del biologico immagini ^25,26,27. Tecniche di analisi di immagine precisa sono necessari per estrarre informazioni quantitative dalle quali spesso sono insiemi di dati complessi e immensi. Tuttavia, alcune misure, soprattutto la misura della capsula di c. neoformans , sono stati difficili da automatizzare. Identificare con precisione l’interfaccia tra la parete delle cellule e la capsula, che generalmente appare come un anello scuro quando immaginata da microscopia di contrasto di fase, può essere fastidioso per risolvere utilizzando una semplice soglia. Ulteriormente, le cellule di c. neoformans nella cultura tendono ad ammassarsi e segmentazione accurata delle cellule è necessaria per misurazioni accurate.

Lo scopo di questo progetto era di (i) illustrare uno dei protocolli standard per induzione capsula in c. neoformans, (ii) confronto e contrasto dell’inchiostro di India e fluorescenza colorazione come si riferiscono a capsula misure di diametro, (iii) sviluppare semplice, metodi computazionali per misurare diametro capsula utilizzando immagini di inchiostro macchiato celle utilizzando un software di analisi di immagine e, (iv) valutano i vantaggi ei limiti di misurazione diametro capsula manualmente e utilizzando il software di automazione. Troviamo che i due metodi di colorazione fluorescenti etichettatura della parete cellulare e capsula, mentre richiede più tempo, fornito i risultati più coerenti tra esperimenti. Tuttavia, entrambi i metodi ci ha permesso di distinguere correttamente tra laboratorio e clinica c. neoformans ceppi che esibiscono diverse capsule dimensioni. Inoltre, siamo stati in grado di automatizzare la misura del diametro capsula da India inchiostro macchiato immagini e scoperto che questo era una valida alternativa alla misurazione manuale della capsula.