Tredimensjonale inflammatorisk menneskelig vev ekvivalenter av Gingiva
Summary
Målet med protokollen er å bygge en inflammatorisk menneskelige gingiva modell i vitro. Denne vev modellen dyrker co tre typer menneskelige celler, HaCaT keratinocytter, gingival fibroblaster og THP-1 makrofager, tredimensjonale vilkår. Denne modellen kan brukes til å undersøke periodontal sykdommer, som gingivitt og periodontitt.
Abstract
Periodontal sykdommer (som gingivitt og periodontitt) er de viktigste årsakene til tap av tenner hos voksne. Betennelse i gingiva er den grunnleggende physiopathology av periodontal sykdommen. Aktuelle eksperimentelle modeller av periodontal sykdommen er etablert i ulike typer dyr. Physiopathology dyr modeller er imidlertid forskjellig fra mennesker, gjør det vanskelig å analysere cellulære og molekylære mekanismer og evaluere nye medisiner for periodontal sykdommen. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å rekonstruere menneskelig inflammatorisk vev ekvivalenter av gingiva (iGTE) i vitro. Vi bygger først menneskelig vev ekvivalenter av gingiva (GTE) ved å bruke to typer menneskelige celler, inkludert menneskelige gingival fibroblaster (HGF) og menneskelig hud epidermal keratinocytter (HaCaT), under tredimensjonale forhold. Vi skaper en såret modell ved et vev-puncher til å slå et hull i GTE. Neste, menneskelige THP-1 monocytter blandet med kollagen gel er injisert inn i hullet i GTE. Ved adimistration av 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 72 h, THP-1 celler differensiert i makrofager til skjemaet inflammatorisk foci i GTE (iGTE) (IGTE også kan være stumilated med 2 µg/mL lipopolysaccharides (LPS) for 48 timer å starte betennelse ). IGTE er den første i vitro modellen av inflammatoriske gingiva menneskelige celler med en tredimensjonal arkitektur. IGTE gjenspeiler store patologiske forandringer (immunocytes aktivitetene, intracellulær interaksjon mellom fibryoblasts, epitelceller, monocytter og makrofager) i periodontal sykdommer. GTE, sårede GTE og iGTE kan brukes som allsidig verktøy for å studere sårheling, vev gjenfødelse, betennelse, celle-celle samhandling og skjermen potensielle medisiner for periodontal sykdommen.
Introduction
Periodontal sykdommer er den ledende årsaken til tap av tenner hos voksne. Gingivitt og periodontitt er de vanligste periodontal sykdommene. Begge presentere biofilm-mediert akutt eller kronisk inflammatorisk endringer i gingiva. Gingivitt er preget av akutt betennelse, mens periodontitt vanligvis presenterer som kronisk betennelse. På histologiske nivå utløse bakteriell komponenter aktivering av immunceller, som makrofager, lymfocytter, plasma celler og mastceller1,2. Disse immunceller, spesielt makrofager, samhandle med lokale celler (inkludert gingival epitelceller, fibroblaster, endotelceller og osteoblasts) som resulterer i inflammatoriske lesjoner i periodontale vev3,4. Eksperimentelle modeller av periodontal sykdommen er etablert i ulike typer av dyr, som rotter, hamstere, kaniner, oppspore, hjørnetann og primater. Physiopathology dyr modeller er imidlertid forskjellig fra mennesker, gjør det vanskelig å analysere cellulære og molekylære mekanismer og evaluere nye medisiner periodontal sykdommer5. Co dyrking av periodontal bakterier og monolayer menneskelig muntlig epitelceller er brukt til å undersøke mekanisme periodontal infeksjoner6. Likevel mangler monolayer kulturer av muntlig celler tredimensjonale (3D) mobilnettet arkitektur intakt vev; Derfor kan de etterligner i vitro situasjonen.
Her, opprettes 3D inflammatorisk menneskelig vev ekvivalenter av gingiva (iGTE) representerer periodontal sykdommer i vitro. Denne 3D-modell av periodontal sykdommen har en mellomliggende beliggenhet mellom monolayer cellekulturer og dyr modeller. Tre typer menneskelige celler, inkludert HaCaT keratinocytter, gingival fibroblaster og THP-1 makrofager, er co dyrket på kollagen gel, og stimulert av inflammatoriske initiativtakerne til å bygge iGTE. IGTE simulerer tett i vivo forhold til celledifferensiering, celle-celle samhandling og macrophage aktivering i gingiva. Denne modellen har mange mulige programmer for screening og teste nye farmakologiske tilnærminger i periodontal sykdommer og analysere cellulære og molekylære mekanismer i sårheling, betennelser og vev gjenfødelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen er basert på metoder for å lage gingival vev ekvivalenter og underhud fettvev ekvivalenter beskrevet av tidligere rapporter8,21,22. Selv om dette er en enkel og lett, krever noen trinnene spesiell oppmerksomhet. For eksempel bør kollagen blandingen holdes på is til bruk for å unngå gel formasjonen i løsningen. Når du legger kollagen blandingen inn kultur innsatsen, kontroller at løsningen ble injisert …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet var støttes delvis av Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (26861689 og 17 K 11813). Forfatterne vil gjerne takke Mr. Nathaniel Green for korrekturlesing.
Materials
| Collagen type I-A | Nitta Gelatin Inc | For making dermis of GTE | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 11900073 | Cell culture medium |
| Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm | Corning, Inc. | 353096 | For tissue culture |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Cell culture reagent |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 31600034 | Cell culture medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Cell culture reagent |
| Tissue puncher | Shibata system service co., LTD | SP-703 | For punching holes in GTE |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 31800022 | Cell culture medium |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | For immunostaining |
| Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain) | Thermo Fisher Scientific | R37605 | For labeling nuclei |
| Fluorescence mount medium | Dako | For mounting samples after immunostaining | |
| Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3] | abcam | ab17139 | For identifying epithelium |
| Scaning electron microscope | Hitachi, Ltd. | HITACHI S-4000 | For observing samples' surface topography and composition |
| Confocal laser scanning microscopy | LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd. | LSM 700 | For observing samples' immunofluorescence staining |
| Anti-Cytokeratin 19 antibody | abcam | ab52625 | For identifying epithelium |
| Anti-vimentin antibody | abcam | ab92547 | For identifying fibroblasts and activated macrophages |
| Anti-TE-7 antibody | Millipore | CBL271 | For identifying fibroblasts in the dermis |
| Anti-CD68 antibody | Sigma-Aldrich | SAB2700244 | For identifying macrophages |
| Human CD14 Antibody | R&D Systems | MAB3832-SP | For identifying macrophages |
| Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A11012 | For immunofluorescence staining |
| Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11001 | For immunofluorescence staining |
| EVOS FL Cell Imaging System | Thermo Fisher Scientific | For observing the sample's immunofluorescence staining | |
| THP-1 cells | Riken BRC cell bank | RCB1189 | For making iGTE |
| PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | For differentiatting THP-1 cells |
Referenzen
- Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
- Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
- Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
- Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
- Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
- Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
- Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
- Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
- Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
- Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
- Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
- Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
- Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
- Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
- Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
- Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).
