Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Pour les cellules de diviser avec succès, ils doivent tout d’abord exactement et fidèlement reproduire leur génome entier. Duplication du génome se produit dans un modèle reproductible, appelé l’ADN réplication calendrier programme¹. Synchronisation de réplication de l’ADN est en corrélation avec l’organisation de la chromatine, marques épigénétiques et gene expression^2,3. Changements dans calendrier de réplication se produisent au cours du développement et sont significativement liés à la transcription des programmes et modifications de la chromatine marques et organisation^4,5. En outre, synchronisation de réplication est corrélée avec des fréquences mutationnelles, et on observe des changements dans le calendrier dans divers types de cancer^6,7,8. Malgré ces observations, les mécanismes et les déterminants de la création de synchronisation de la réplication et la réglementation sont encore largement inconnus et le rôle qu’elle joue dans le développement et la maladie n’est pas déterminée. En outre, jusqu’à récemment la réplication du génome calendrier des changements qui se produisent tout au long du développement des vertébrés avait seulement été examinée en modèles de culture de cellules.

Poisson-zèbre, Danio rerio, sont bien adaptés pour étudier la réplication calendrier in vivo au cours du développement, tel qu’un seul couple peut donner des centaines d’embryons qui se développent rapidement avec nombreuses similitudes avec le développement mammifère^{9, 10}. En outre, tout au long du développement du poisson zèbre, il y a des changements pour le cycle cellulaire, organisation de la chromatine et transcriptionnelles programmes qui partagent des relations avec la réplication de l’ADN calendrier¹¹. Poisson zèbre est aussi un excellent modèle génétique, car ils se prêtent particulièrement à la manipulation par transgénèse, mutagénèse et mutations ciblées, et écrans génétiques ont identifié de nombreux gènes requis pour le développement des vertébrés¹². Par conséquent, poisson zèbre peut être utilisé pour identifier les gènes impliqués dans l’entretien et la création de synchronisation de réplication et d’observer les effets de la déréglementation “timing” réplication sur du développement des vertébrés. Les lignées transgéniques permet également d’évaluer la synchronisation de la réplication de types de cellules individuelles isolées à différents points du développement ou dans des conditions de maladie. Ce qui est important, il existe divers modèles de poisson-zèbre de maladie humaine qui peut être utilisé pour étudier le rôle de la synchronisation de la réplication en maladie la formation et la progression^9,13,14.

Récemment, les profils de synchronisation de réplication premières proviennent du poisson-zèbre, établissant comme un système modèle pour étudier la réplication calendrier in vivo¹⁵. Pour ce faire, les cellules ont été prélevés des embryons de poisson-zèbre à plusieurs étapes de développement et dans un type de cellule isolée du poisson-zèbre adulte. Les cellules ont été ensuite triés par FACS (fluorescence-lancée de cellules tri) basée sur la teneur en ADN pour isoler des populations de phase G1 et S. Utilisez l’exemple de G1 comme un contrôle de nombre de copie, copie numéros variations dans les populations de phase S ont été déterminées et utilisées pour déduire la synchronisation de réplication relative¹⁶. Changements dans calendrier de réplication peuvent être directement comparés entre les différents échantillons de perfectionnement et de types de cellules, et cela a servi à déterminer au moment de la réplication des changements qui se produisent en vivo tout au long du développement des vertébrés. Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes de la génomique, surtout qu’il ne nécessite pas d’étiquetage avec les analogues de la thymidine ou immunoprécipitation d’ADN^4,6.

Voici détaillées les protocoles au point de la réplication de l’ADN profil Génome-large à haute résolution chez le poisson zèbre. Ces protocoles ont été utilisés pour déterminer les relations avec les caractéristiques génomiques et épigénétiques dans le génome du poisson-zèbre, ainsi que des changements dans ces relations qui se produisent au cours du développement de profilage. Ces protocoles sont également facilement adaptés pour étudier les changements dans le calendrier de réplication chez les souches mutantes de poisson-zèbre et dans des modèles de la maladie. En outre, ces méthodes fournissent une base qui peut être étendue à d’étudier le calendrier de réplication dans les cellules spécifiques, par un premier tri sur les types de cellules individuelles du poisson-zèbre. Le poisson-zèbre peut servir comme un excellent en vivo système modèle pour étudier la synchronisation de la réplication et de révéler au bout du compte les fonctions biologiques de ce caractère épigénétique important.