Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde
Summary
Hipoksi normal atmosferik oksijen düzeyleri altında karşılaşan Drosophila melanogaster larva tanımlamak için basit bir tahlil protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı tembellik veya yavaş büyüme gibi örtüşen fenotipleri göstermek başka mutantlar dan ayırt edici olmak hipoksik larva sağlar.
Abstract
Oksijen yetmezliği hayvanlarda düşük atmosferik oksijen düzeyleri maruz veya oksijen dağılımı ile müdahale iç doku hasarına neden olabilir. Oksijen algılamalı nöronların anormal davranış hipoksi gibi davranış varlığında normal oksijen seviyesi neden mümkündür. D. melanogasteriçinde büyüme ve halsiz davranış inhibisyonu larva evreleri sırasında düşük oksijen düzeyleri geliştirme sonuçlanır. Ancak, oksijen açığı kurulan bu belirtileri önemli ölçüde büyüme, stres yanıt veya hareket düzenleyen birçok mutasyon fenotipleri ile çakışıyor. Sonuç olarak, orada şu anda hiçbir tahlil i) hücresel hipoksiyadan bir mutasyon veya II) hipoksi gibi davranış ne zaman anormal nöronal davranış tarafından indüklenen tarafından indüklenen tanımlamak kullanılabilir.
Biz son zamanlarda normal oksijen düzeyleri hipoksi dahili algılama yanıt olarak oluşan D. melanogaster larva iki farklı davranışları belirledik. İlk olarak, her aşamasında bu tür larva gıda kez uzak straying bir besin kaynağı, içine burrowing kaçının. Larva hipoksik ise ikinci olarak, yumuşak bir terkedilemeyen tünel, normalde göçebe üçüncü INSTAR aşamasında oluştuğu tamamen kaldırıldı. Burada açıklanan tahlil algılamak ve bu davranışları quantitate için tasarlanmıştır ve bu nedenle hipoksi indüklenen düşük dış oksijen yerine iç hasar tarafından tespit etmek için bir yol sağlamak için. Tahlil plakaları bir agar terkedilemeyen ve Maya hamur merkezi bir fiş ile hayvanlar larva ömrü boyunca desteklemek için kullanılır. Üçüncü ilk biçim devam ederken pozisyonları ve larvalar durumunu günlük izlenir. Göçebe aşamasında agar terkedilemeyen tünel ölçüde NIH ImageJ kullanarak pupation sonra quantitated. Tahlil ne zaman hipoksi bir mutant bir fenotip bileşenidir belirlemede değerli olacak ve böylece eylem söz konusu genin olası siteleri içgörü sağlamak.
Introduction
Moleküler genetik araçlar D. melanogaster içinde kullanılabilir Gelişmiş dizi örümceklerle korunmuş biyolojik süreçlerin çalışma için değerli bir organizma olun. Oksijen durumu anahtar moleküler yanıt evrim arasında korunmuş kanıtlanmıştır ve D. melanogaster önceki çalışmalarda bu yolları 1,2sinyal evrensel bileşenleri anlayışlar üretilip, 3,4,5,6.
D. melanogaster larva işlevinde duyusal nöron anatomi amaçlı bir çalışmanın bir parçası olarak, biz doku hipoksi normal oksijen düzeyleri 7tarafından etkinleştirilmesi ortaya çıktı iki davranışsal yanıt tespit. Bunlardan biri, maması, yuva hatası son derece düşük oksijen düzeyleri Wingrove ve O’Farrell 8tarafından bildirilen yanıt ilgilidir. İkinci davranış yumuşak bir terkedilemeyen faz, göçebe geç üçüncü biçim sırasında tünel için hata daha önce olarak hipoksi ile ilgili tespit edilmedi değil. Vahşi türü göçebe larva düşük oksijen düzeylerine maruz kalmaları da 7, tünel terkedilemeyen engeller böylece kurulması hem bu davranışlar hipoksi kaynaklanan – ya doku hasarı veya düşük oksijen alımını düzeyleri tarafından indüklenen belirledi. Burada hemen larva tarama sonra gözlemleri ile başlayan bu iki hipoksi indüklenen davranışlar, quantitate için geliştirdiğimiz bir tahlil açıklayın.
Erken larva evresinde hipoksik yanıt daha önce muayene değil ve bu nedenle bir çözümlemesini larva hayatı boyunca bizim tahlil, değerli bir bileşenidir. Hipoksi-yavaş geliştirme, zavallı büyüme ve Lokomotor tembellik-belirgin belirtileri çoğu larva fenotipleri birçok mutasyon tarafından üretilen ile çakışıyor. Ama biz sadece üçüncü INSTAR larva hipoksi ile 7tünel için tam bir başarısızlık gösterir bulduk. Bu yüzden, biz bile larva daha büyüme ve hareket açısından bizim hipoksik larva uzlaşma, hipoksik larva asla 7tünel, ancak hala bazı tünel, gerçekleştirilen belirlenir. Başka bir değerli Bu testin böylece hipoksi başka stres veya metabolik bozukluk karşı pleiotropic fenotipleri belirli bir dizi kaynak olduğunda oluşturmak için bir yol sağlayan öğedir. Testin gücümüzü, burada tarif biz larva yanıt azaltılmış trakeal ifade ile karakterize içinde kullanımı uninflatable, larva Havayolları 9‘ fonksiyonları bir gen.
Bu tahlil zavallı büyüme ve halsiz davranışı içerir larva fenotipleri karakterize uğraşan araştırmacılar için değerli olacağını öngörmektedir. Sonuç olarak, dağıtım, kullanımı veya yanıt için etkisi yeni genlerin vücuda oksijen belirlenmiştir. Ayrıca, bu tahlil Protokolü eleme bir mutant birleşmeyle hipoksi üretmek mutasyonlar belirlenmesi için doğrudan bir yol sağlar. Bu tahlil de burada açıklanan hipoksi indüklenen doğuştan gelen davranışlarını ortaya çıkarır devre analiz değerli olacaktır. Bu tür sinir ağı analizi çok geçerli araştırma bir odak noktasıdır ve D. melanogaster larva basit sinir sistemi otomatik davranışları dissekan için değerli bir sistemdir. Duyusal nöronlar larva oksijen algı dahil zaten, hipoksi indüklenen yanıtları 10,11tam devre tanımlama yolunda ilk adım sağlayan tespit edilmiştir. Bizim tahlil GAL4-UAS sistem12 ile seçici sinirsel nakavt ile birlikte daha da operasyona neural ağ bileşenleri için açık bir yol kullanmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada doku hipoksi D. melanogaster larva algılamak için tasarlanmış basit bir tahlil sundu. Tanı azalma gıda höyükler larva Gençliği ve geç larva hayatta tünel terkedilemeyen yokluğu içine burrowing üzerinde temel alır. Larva kalabalık bir besin kaynağı uzak erken geçiş neden olabilir ve bu nedenle önemli bir özelliği, tahlil larva az sayıda varlığında büyük bir aşırı gıda denetlesinler. Ağar kaplamalar içine mantar ilacı metil-p hidroksil benzoat (Nipagen) dahil de küf gelişimi sırasında tahlil önlemek için önemlidir.
Ağar kaplamalar tahlil değişkenlik bir kaynağı olabilir bulmak. Genellikle, aynı genotip, ebeveynlerin farklı toplu işlemleri veya larva, farklı koleksiyon larvaları davranışlarını tahlil nispeten sınırlı değişim gösterir. Buna ek olarak, Ağar kaplamalar veya farklı günlerde yapılan agar farklı toplu işlemleri ile tünel farklılıklar yol açabilir. Bir hükmü bu nedenle bu denetimi ve deneysel larva tüm Ağar kaplamalar aynı toplu iş hazırlık üzerinden kullanarak test edilmelidir. Agar farklı üreticilerin veya aynı üretim üzerinden bile sevk irsaliyelerini jelleşme güçlerini değişebilir ve bu yüzden yukarı doğru %2.2 burada en iyi bir jel elde etmek için kullanılan ayarla agar konsantrasyon gerekli olabilir. Biz vahşi türü larva kolayca % 3 agar jelleri yuva bulduk.
Bu tahlil değerini göstermek için biz larva bastırılmış fonksiyonu ile potansiyel doku hipoksi araştırmak için kullanılmış uninflatable tracheae. içinde Cihazla ilgili izlenimlerimizi trakeal ifade bu gen kaybı hipoksi üretebilir hipotez için güçlü destek sağlamak: btl-Gal4 > UAS –UIF RNAi larvalar yiyecek ve terkedilemeyen sırasında tünel olmaması içine yuva için hata gösterdi Üçüncü biçim. Diğer genotip bizim önceki çalışmalarda, biz gıda burrowing hipoksi indüklenen kayb terkedilemeyen tünel kaybı ve btltam değil gözlenen-Gal4 > UAS –UIF RNAi larvaları okudum burada benzer şekilde davrandım. Bu testin başarısız tünel bileşeni bu nedenle hipoksi en güçlü bilgi vermez.
Her ne kadar btl-Gal4 > UIf RNAi larva davranış özellikleri hipoksi, kesmek(ue) tanı gösterdi-Gal4 > UAS –UIF RNAi değil bu anormallikler sergi. Btl ve kesme(ue) sürücüleri farklı aşamalarında ve larva tracheae içinde farklı desenler ifade Gal4. Btl-Gal4 sürücü embriyo gelişimi başlayarak ve larva hayatı boyunca devam eden trakeal sistem boyunca ifade edilir. Buna karşılık, Gal4 ifade kesmek(ue)-Gal4 sürücü sadece embriyonik hayatın sonunda tracheae morfogenetik sonra başlar ve dorsal gövdeleri, büyük boyuna gemilerin aşırı arka bölümlerine sınırlı olmalıdır trakeal sistemi. Bu Gal4 hattı ile UIF nakavt değil bu nedenle azaltmak UIF ifade yeterince erken ya da genel olarak yeterli hipoksi davranışları tetiklemek için gerekli bazı eşik düzeyini üretmek için ölçülen bu tahlil.
Bir önceki çalışma üçüncü INSTAR larva düşük (% 10) oksijen düzeylerine maruz azalmış büyüme göstermek buldum ve pupariation 14başlangıcı gecikmiş. Btl-Gal4 > RNAi burada okudu UAS – larvaUIF üçüncü INSTAR ilerledi ama onların büyüme ve pupation oranları üzerindeki etkileri daha belirgin olduğunu: denetimleri altında çok az yağ dokusu ile önemli ölçüde daha küçük olduklarını epidermis (şekil 3) ve yalnızca küçük bir kısmını (~ %10) pupariation çalıştı. Bu farklılıklar btlöneririz-Gal4 > UAS –UIF RNAi larva deneyimli hipoksi, daha büyük bir ölçüde UIF nakavt tracheae içinde bütün larva yaşamları mevcut olduğu için veya daha fazla üretilen çünkü şiddetli oksijen yoksunluğu üçüncü biçim içinde. Nasıl tracheae bir UIF işlev kaybı oksijen taşıma engel olabilir bu noktada belirsizdir. Btltracheae-Gal4 > UAS –UIF RNAi larva kütikül (şekil 3), bir gösterge yer alan hava ve sıvı giriş işlevi uzlaşma noktası zarar görmüş değil aracılığıyla kolayca görünür. Bu nedenle UIF fonksiyon kaybı tarafından oluşturulan trakeal hasarın hipoksi ama tünel engeller oldukça bazı diğer kusur temin etmez resmen mümkündür. Daha önce okudu genotip için başarısızlık tünel için geç üçüncü INSTAR larva 15‘ te karaciğer mRNA7düzeyleri, kurallı göstergesi Glikoliz ve hipoksi ile ilişkili olduğunu belirledi. Böylece, teyidi için btlhipoksi-Gal4 > UAS –UIF RNAi larva (ve gelecekte muayene larva Bu testin kullanın) karaciğer mRNA düzeyleri veya ölçmek için piyasada bulunan bir göstergesi kullanımı değerlendirmek için RT-PCR yer alacağı Hücre içi oksijen düzeyleri (örneğin bkz: 16).
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Karen M. Qiang George J. Schroepfer Araştırma Ödülü Rice Üniversitesi 2016 alıcı oldu. Fanli Zhou Rice Üniversitesi’nden öğretim bursu alıcı olduğunu. Bloomington Drosophila stok Merkezi, Harvard gezi tesisi hizmetleri Viyana Drosophila Kaynak Merkezi minnetle kabul vardır.
Materials
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
Referenzen
- O’Farrell, P. H. Conserved responses to oxygen deprivation. J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).
- Lavista-Llanos, S., et al. Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar. Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).
- Reiling, J. H., Hafen, E. The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster. Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).
- Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates. J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).
- Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective. Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).
- Dijkers, P. F., O’Farrell, P. H. Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade. Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).
- Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae. PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).
- Wingrove, J. A., O’Farrell, P. H. Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster. Cell. 98 (1), 105-114 (1999).
- Zhang, L., Ward, R. E. Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster. Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).
- Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster. J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).
- Morton, D. B. Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae. Fly. 5 (2), 119-125 (2011).
- Brand, A., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. Looking at embryos. Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).
- Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster. J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).
- Li, Y., et al. Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster. PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).
- Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark. Scient. Rep. 5 (9061), (2015).
