Fettsäure- 13C Isotopologue Profilierung gibt Einblick in trophische Carbon Transfer und Fettstoffwechsel der Wirbellosen Verbraucher
Summary
Die Fettsäure trophische Marker Ansatz, d. h. die Aufnahme von Fettsäuren als gesamte Molekül und Transfer in das Gewebe der Verbraucher ohne oder geringfügige Änderung, durch Wissenslücken im Fettsäure-Stoffwechsel der kleinen Boden Wirbellosen behindert wird. Isotopologue Profilierung dient als ein wertvolles Instrument zur trophische Interaktionen zu entwirren.
Abstract
Fettsäuren (FAs) sind nützliche Biomarker im Nahrungsnetz Ökologie, denn sie sind in der Regel als vollständige Molekül assimiliert und in Verbraucher-Gewebe mit Minderjährigen oder keine Änderung, so dass die diätetische routing zwischen verschiedenen trophischen Ebenen übertragen. Der FA-trophische Marker-Ansatz ist allerdings immer noch durch die begrenzte Kenntnisse in Lipidstoffwechsel von der Bodenfauna behindert. Diese Studie verwendete völlig gekennzeichneten Palmitinsäure (13C16:0, 99 % der Atom) als Tracer in Fettsäure-Stoffwechsel Bahnen von zwei weit verbreitete Boden Collembolen, Protaphorura Fimata und Heteromurus Redwood. Um das Schicksal und die metabolischen Veränderungen dieser Vorstufe zu untersuchen, ist eine Methode des Isotopologue profiling vorgestellt, durch Massenspektrometrie mit dem einzelnen Ion monitoring durchgeführt. Darüber hinaus wird die vorgelagerten Labor Fütterungsversuch sowie die Extraktion und die Methylierung von dominanten Lipid Brüche (neutralen Lipiden, Phospholipiden) und die zugehörige Formel und Berechnungen beschrieben. Nicht nur Ausbeute 13C beschriftet Vorläufer die insgesamt 13C-Anreicherung in Fettsäuren abgeleitet sondern produziert auch das Muster der Isotopologues überschreiten die Masse des Ions (d. h. das FA molekularen Ion Elternteil Isotopologue Profilierung M+) jeweils mit der Bezeichnung FA durch eine oder mehrere Masseneinheiten (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.). Dieses Wissen erlaubt Rückschlüsse auf das Verhältnis der diätetischen routing von einem völlig verbrauchte FA im Vergleich zu de-Novo -Biosynthese. Die Isotopologue Profilierung empfiehlt sich als ein nützliches Instrument zur Bewertung der Fettsäure-Stoffwechsel in Bodentiere trophische Interaktionen zu entwirren.
Introduction
In einem kryptischen Lebensraum wie Boden trophische Beziehungen sind schwer zu Adresse und sind durch die geringe Größe der Fauna weiter beschränkt. Im letzte Jahrzehnt hat Fortschritte in biochemische Ökologie, insbesondere bei der Verwendung von Fettsäuren als Biomarker für die Definition von Fütter Strategien der Bodenfauna unter Feld Bedingungen1,2,3gesehen. Dies ist, dass Fettsäuren aus Ressourcen in Verbraucher-Gewebe als gesamte Moleküle eingebaut werden können, bezeichnet ein Prozess diätetische routing4. Übertragung von Fettsäuren ist über drei trophischen Ebenen, d. h. aus Pilzen, Nematoden, Collembolen5berichtet worden. Vor kurzem, die räuberischen Fauna galt6,7 und die ersten Reviews auf Fettsäuren als trophische Markierungen im Boden Nahrungsnetze wurden veröffentlicht8,9.
Nähere Informationen zu trophischen Interaktionen wird durch Fettsäure-stabiler Isotope probing (FA-SIP) erreicht. Die Bestimmung von 13C /12C-Verhältnisse in Fettsäuren in Diäten und Verbraucher können zuschreiben binäre Verknüpfungen und Abschätzung den damit verbundenen CO2-Fluss und beschäftigt in terrestrischen, Süßwasser und marinen Nahrungsnetze10,11 ,12,13. Die Grundannahme ist, dass weitergeleitete diätetischen Fettsäuren nicht enzymatischen Prozessen unterworfen sind; daher ihre 13C signal, d. h. 13C /12C Verhältnis der Fettsäure in der Konsumgüterindustrie ist ähnlich wie in der Diät-1. Jedoch wurde eine allmähliche Entleerung der 13C Signatur oben in der Nahrungskette in aquatischen Systemen, dadurch behindern breite Anwendung des FA-SIP trophische Studien14,15,16berichtet. Kenntnisse in den Lipidstoffwechsel in den meisten Wirbellosen in terrestrischen Nahrungsketten ist übrigens nach wie vor begrenzt.
Das Verständnis der Lipid Metabolismus Bahnen bei den Verbrauchern ist Voraussetzung für die Nutzung der trophischen Marker Fettsäuren als Mittel zur Bestimmung der quantitativen Kohlenstoff Strömung im Nahrungsnetz Ökologie. Mit diesem im Verstand, 13C-Isotopologue Profilierung, welche im Prinzip für die Untersuchung von Kohlenstoff-Stoffwechsel jedes biologische System17, angewendet werden kann ist eine vielversprechende Methode. Nach der Einführung des 13C gekennzeichnet Carbon Substrat, die Verteilung der 13C in der metabolischen Netzwerkes ist seit der erzeugten Stoffwechselprodukte in der Consumer-Show eine spezifische Isotopologue Verteilung nachvollziehbar. Dies kann durch quantitative nukleare metabolische Resonanz Spektroskopie18,19 oder Massenspektrometrie20,21, mit der letzteren bevorzugten in biologischen Proben mit niedrigen Biomasse aufgrund seiner höheren beurteilt werden Empfindlichkeit.
Obwohl Isotopologue Profilierung wurde erfolgreich angewendet, Aminosäuren und bot Einblick in den in-Vivo Kohlenstoff-Stoffwechsel der bakteriellen Krankheitserregern17,22,23, deren Umsetzung in Fettsäuren Säuren ist zurückgeblieben. Die erste detaillierte Analyse über das Schicksal von einem stabilen isotopenmarkierter Vorläufer Fettsäure, diätetische routing oder Abbau durch β-Oxidation, Boden Wirbellosen Verbraucher, wurde vor kurzem von Menzel Et Al. durchgeführt. 24. hier werden die methodischen Grundlagen für Einbau Experimente mit 13C gekennzeichnet, gefolgt von Isotopologue Analyse der wichtigsten Nachkommen in häufigen Boden Wirbellosen, die Collembolen Fettsäuren zur Verfügung gestellt. Diese Microarthropods sind ein gutes Modell-Gruppe, da sie wichtige Bestandteile des Bodens Nahrungsnetz und sind gut für ihre trophische Marker Fettsäuren8,25untersucht bilden.
Das Verständnis der Lipid Metabolismus Bahnen bei den Verbrauchern ist Voraussetzung für die Nutzung der trophischen Marker Fettsäuren als Mittel zur Bestimmung der quantitativen Kohlenstoff Strömung im Nahrungsnetz Ökologie. Dieses Protokoll bietet das Design und die Einrichtung für ein Labor Ernährung Experiment und die biochemische Verfahren zur Extraktion und Methylierung von dominanten Lipide Brüche (neutralen Lipiden, Phospholipiden) von Collembolen. Es zeigt, wie die Isotopologue Zusammensetzung der Fettsäuren durch Massenspektrometrie analysiert wird und beschreibt die zugehörige Formel und Berechnungen. Dieses Verfahren führt zu: (i) die Verhältnisse der Isotopologues überschreiten die Masse des Ions (d. h. die Fettsäure Molekulare Ionen M+) Eltern von einem oder mehreren mass-Einheiten (M+ 1M+ 2M+ 3, etc.) und (Ii) die gesamte 13 C-Anreicherung in Fettsäuren abgeleitet aus den 13C gekennzeichneten Vorläufer. Obwohl für Collembolen verwendet, kann dieser Ansatz in der Regel auf andere Räuber-Beute-Interaktion auf der Prämisse angewendet werden, dass diese sind in ausreichender Menge unter kontrollierten Bedingungen zu eine erfolgreichen Label Akzeptanz zu gewährleisten und anschließende Überprüfung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isotopologue Profilierung
Eine detaillierte Analyse der quantitativen Aspekte bei 13C Verteilung in FAs braucht Spitzentechnologie, Kohlenstoff in Nahrungsketten Partitionierung zuzuweisen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt Isotopologue Profilierung zur Beurteilung der 13C /12C-Verhältnisse in gemeinsamen FA Biomarker für tropische Interaktionen. Diese Methode ist gut etabliert für Aminosäureanalyse von Flüssigchromatographie (LC-MS) und…
Acknowledgements
Die finanzielle Unterstützung von R. Menzel und L. Ruess von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (RU RU780/11-1) ist dankbar anerkannt. R. Nehring wurde von RU 780/10-1 finanziert. Schließlich sind wir sehr dankbar, dass Dr. Hazel Ruvimbo Maboreke für das Korrekturlesen unserer Handschrift.
Materials
| neoLab-Round jars | neoLab | 2-1506 | 69 x 40 mm, 10 pacs/pack |
| Charcoal activated | Carl Roth | X865.1 | p.a., powder, CAS No. 7440-44-0 |
| Alabaster Dental | RÖHRICH-GIPSE | — | http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Methanol | Carl Roth | P717.1 | HPLC ≥ 99,9 % |
| Hexan | Carl Roth | 7339.1 | HPLC ≥ 98 % |
| tert-Butyl methyl ether (MTBE) | Carl Roth | T175.1 | HPLC ≥ 99,5 % |
| Aceton | Carl Roth | 7328.2 | HPLC ≥ 99,9 % |
| NaOH | Carl Roth | 6771.1 | p.a. ≥99 %, in pellets |
| di-Natriumhydrogenphosphat | Carl Roth | P030.1 | p.a. ≥99 % , water free |
| Na-dihydrogenphosphat Dihydrat | Carl Roth | T879.1 | p.a. ≥99 % |
| Hypochloric acid (6 N) | VWR International | 26,115,000 | AVS TITRINORM vol. solution |
| Bond Elut (Columns) | Agilent Tech. | 14102037 | HF Bond Elut-SI, 500 mg, 3 mL, 50/PK |
| Präparatengläser Duran | Glasgerätebau Ochs | 135215 | Ø 16 x 100 mm, plus screw cap with handy knurl and integrated PTFE/silicone gasket |
| Supelco 37 Component FAME Mix | Sigma-Aldrich | 47885-U Supelco | 10 mg/mL in methylene chloride, analytical standard |
| FlowMesh | Carl Roth | 2796.1 | Polypropylene mesh, approximately 0.3 mm thick, with 1 mm strand spacing |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco | 10 mg/mL in methyl caproate, analytical standard |
| Methyl nonadecanoate | Sigma-Aldrich | 74208 | analytical standard ≥ 98.0 % |
| Hexadecanoic acid-1-13C (Palmitic) | Larodan Fine Chemicals | 78-1600 | GC ≥ 98.0 % (13C: 99.0 %) |
| RVC 2-25 CDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Compact benchtop midi concentrator | |
| Alpha 2-4 LDplus | Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen | Drying manifold | |
| MZ 2C NT | Vacuubrand GMBH | Vacuum pump | |
| Roto-Shake Genie | Scientific Industries | Combined rocking and rotating device | |
| XP64 Micro Comparator | Mettler Toledo | Super high precision balance | |
| GC-System 7890A | Agilent Tech. | Gas chromatograph | |
| 7000 GC/MS Triple Quad | Agilent Tech. | Triple Quad mass spectrometer | |
| 7683B Series Injector | Agilent Tech. | Sample injector | |
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | Centrifuge with 10 ml tube rotor |
Referenzen
- Ruess, L., et al. Application of lipid analysis to understand trophic interactions in soil. Ecology. 86 (8), 2075-2082 (2005).
- Ruess, L., et al. Lipid composition of Collembola and their food resources in deciduous forest stands – Implications for feeding strategies. Soil Biology and Biochemistry. 39 (8), 1990-2000 (1990).
- Chamberlain, P. M., Bull, I. D., Black, H. I. J., Ineson, P., Evershed, R. P. Fatty acid composition and change in Collembola fed differing diets: identification of trophic biomarkers. Soil Biology and Biochemistry. 37 (9), 1608-1624 (2005).
- Stott, A. W., Davies, E., Evershed, R. P., Tuross, N. Monitoring the routing of dietary and biosynthesised lipids through compound-specific stable isotope (delta C-13) measurements at natural abundance. Naturwissenschaften. 84 (2), 82-86 (1997).
- Ruess, L., Haggblom, M. M., Langel, R., Scheu, S. Nitrogen isotope ratios and fatty acid composition as indicators of animal diets in belowground systems. Oecologia. 139 (3), 336-346 (2004).
- Pollierer, M. M., Scheu, S., Haubert, D. Taking it to the next level: Trophic transfer of marker fatty acids from basal resource to predators. Soil Biology and Biochemistry. 42 (6), 919-925 (2010).
- Ferlian, O., Scheu, S., Pollierer, M. M. Trophic interactions in centipedes (Chilopoda, Myriapoda) as indicated by fatty acid patterns: Variations with life stage, forest age and season. Soil Biology and Biochemistry. 52, 33-42 (2012).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biology and Biochemistry. 42 (11), 1898-1910 (2010).
- Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically characterising trophic networks: What emerging DNA-based methods, stable isotope and fatty acid analyses can offer. Adv Ecol Res. 49, 177-224 (2013).
- Hammer, B. T., Fogel, M. L., Hoering, T. C. Stable carbon isotope ratios of fatty acids in seagrass and redhead ducks. Chemical Geology. 152 (1-2), 29-41 (1998).
- Budge, S. M., Iverson, S. J., Koopman, H. N. Studying trophic ecology in marine ecosystems using fatty acids: A primer on analysis and interpretation. Marine Mammal Science. 22 (4), 759-801 (2006).
- Haubert, D., et al. Trophic structure and major trophic links in conventional versus organic farming systems as indicated by carbon stable isotope ratios of fatty acids. Oikos. 118 (10), 1579-1589 (2009).
- Ngosong, C., Raupp, J., Richnow, H. H., Ruess, L. Tracking Collembola feeding strategies by the natural 13C signal of fatty acids in an arable soil with different fertilizer regimes. Pedobiologia. 54 (4), 225-233 (2011).
- Bec, A., et al. Assessing the reliability of fatty acid-specific stable isotope analysis for trophic studies. Methods in Ecology and Evolution. 2 (6), 651-659 (2011).
- Gladyshev, M. I., Makhutova, O. N., Kravchuk, E. S., Anishchenko, O. V., Sushchik, N. N. Stable isotope fractionation of fatty acids of Daphnia fed laboratory cultures of microalgae. Limnologica. 56 (Supplement C. 56 (Supplement C), 23-29 (2016).
- Gladyshev, M. I., Sushchik, N. N., Kalachova, G. S., Makhutova, O. N. Stable isotope composition of fatty acids in organisms of different trophic levels in the Yenisei river. PLoS One. 7 (3), e34059 (2012).
- Eisenreich, W., Dandekar, T., Heesemann, J., Goebel, W. Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 401-412 (2010).
- Eylert, E., Bacher, A., Eisenreich, W. NMR-based isotopologue profiling of microbial carotenoids. Methods Mol Biol. 892, 315-333 (2012).
- Garton, N. J., O’Hare, H. M. Tuberculosis: feeding the enemy. Chemical Biology. 20 (8), 971-972 (2013).
- Rosenblatt, J., Chinkes, D., Wolfe, M., Wolfe, R. R. Stable isotope tracer analysis by GC-MS, including quantification of isotopomer effects. Am J Physiol. 263 (3), E584-E596 (1992).
- Fernandez, C. A., Des Rosiers, C., Previs, S. F., David, F., Brunengraber, H. Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance. J Mass Spectrom. 31 (3), 255-262 (1996).
- Heuner, K., Eisenreich, W. The intracellular metabolism of legionella by isotopologue profiling. Methods Mol Biol. 954, 163-181 (2013).
- Willenborg, J., et al. Characterization of the pivotal carbon metabolism of Streptococcus suis serotype 2 under ex vivo and chemically defined in vitro conditions by isotopologue profiling. J Biol Chem. 290 (9), 5840-5854 (2015).
- Menzel, R., Ngosong, C., Ruess, L. Isotopologue profiling enables insights into dietary routing and metabolism of trophic biomarker fatty acids. Chemoecology. 27 (3), 101-114 (2017).
- Buse, T., Ruess, L., Filser, J. New trophic biomarkers for Collembola reared on algal diets. Pedobiologia. 56 (3), 153-159 (2013).
- Hutson, B. R. Effects of variations of the plaster-charcoal culture method on a Collembolan, Folsomia candida. Pedobiologia. 18, 138-144 (1978).
- Fountain, M. T., Hopkin, S. P. Folsomia candida (Collembola): a "standard" soil arthropod. Annu Rev Entomol. 50, 201-222 (2005).
- ISO, I. O. f. S. . Soil Quality-Inhibition of reproduction of Collembola (Folsomia candida) by soil pollutants. , (1999).
- Welch, D. F. Applications of cellular fatty acid analysis. Clin Microbiol Rev. 4 (4), 422-438 (1991).
- Dodds, E. D., McCoy, M. R., Rea, L. D., Kennish, J. M. Gas chromatographic quantification of fatty acid methyl esters: flame ionization detection vs. electron impact mass spectrometry. Lipids. 40 (4), 419-428 (2005).
- Kuppardt, S., Chatzinotas, A., Kastner, M. Development of a fatty acid and RNA stable isotope probing-based method for tracking protist grazing on bacteria in wastewater. Appl Environ Microbiol. 76 (24), 8222-8230 (2010).
- Zhang, X., He, H., Amelung, W. A GC/MS method for the assessment of 15N and 13C incorporation into soil amino acid enantiomers. Soil Biology and Biochemistry. 39 (11), 2785-2796 (2007).
- Vetter, W., Thurnhofer, S. Analysis of fatty acids by mass spectrometry in the selected ion monitoring mode. Lipid Technol. 19 (8), 184-186 (2007).
- Thurnhofer, S., Vetter, W. A gas chromatography/electron ionization-mass spectrometry-selected ion monitoring method for determining the fatty acid pattern in food after formation of fatty acid methyl esters. J Agric Food Chem. 53 (23), 8896-8903 (2005).
- Haubert, D., Haggblom, M. M., Scheu, S., Ruess, L. Effects of fungal food quality and starvation on the fatty acid composition of Protaphorura fimata (Collembola). Comparative Biochemistry and Physiology B-Biochemistry & Molecular Biology. 138 (1), 41-52 (2004).
