Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

Protein-komplexen Baugruppe ist ein Schlüsselprozess bei der Aufrechterhaltung der raumzeitlichen Spezifität von vielen Signalisierung Wege^1,2. Während die kritische Natur dieser regulatorische Rolle allgemein anerkannt ist, gibt es ein Mangel an experimentellen Techniken zur Verfügung, um diese komplexe unter die Lupe nehmen. Die meisten phänotypische Studien konzentrieren sich auf Interaktionen mit einzelne Proteine oder die sequentielle Bereicherung einzelner komplexe Komponenten. Hier präsentieren wir eine Technik für die Isolierung von einem spezifischen Protein-Dimer, während mit Ausnahme der einzelnen Moieties Komponente Proteine sowie komplexe mit konkurrierenden verbindliche Partner³gebildet. Wir haben diese Technik namens Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP), es ist eine Kombination eines bereits vorhandenen Protein Fragment Komplementierung Assays, Bimolekulare Fluoreszenz-Ergänzung (BiFC), mit dem neuartigen Einsatz von einer Konformation-spezifische rekombinante gemeinnützige GFP und seine Derivate (siehe Table of Materials).

Ein typische Protein-Fragment Komplementierung Assay stützt sich auf den Ausdruck der “Köder” und “Beute” Proteine verschmolzen um Fragmente der Reporter wie Luciferase⁴, β-Galaktosidase⁵oder grün fluoreszierendes Protein (GFP)⁶ ( teilen Abbildung 1A). Durch das Zusammenspiel der Köder und Beute Proteine sollen die Split-Reporter-Domänen in eine funktionale Struktur, so dass die Interaktion des Köders Umfalten und Beute Proteine visualisiert oder quantifiziert werden. BiCAP wurde von einer Version dieser Technik, die aus der Fragmente der GFP Variante Venus verwenden. Fluoreszierendes Protein-Ergänzung-Assays sind eine beliebte Methode zur Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in einer live-Zelle, aber bis jetzt wurden auf diese eine Funktion⁷beschränkt. BiCAP stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Hinsicht, da diese Technik nicht nur zur Visualisierung, aber auch die Isolation und Verhöre der daraus resultierenden Protein-Protein Interaktion erlaubt.

Abbildung 1: die strukturelle wichtigsten hinter die BiCAP Technik. (A) ein Schema skizziert die wichtigsten hinter Bimolekulare Fluoreszenz Ergänzung zeigt “bait” und “Beute” Proteine mit der N-terminalen V1 oder V2 C-terminale Fragmente des Full-Length Venus Proteins markiert. (B) strukturelle Analyse der Interaktion (Cyan) Schnittstelle zwischen der GFP gemeinnützige (grün) und rekombinierte Venus, welche die Position der (grau) V1 und V2 (orange) Fragmente (PDB Beitritt 3OGO). Diese Zahl ist neu veröffentlichte FromCroucher Et Al.³ Abdruck mit freundlicher Genehmigung von AAAS. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

BiCAP macht Technik verwenden zwei nicht fluoreszierenden Fragmente der Venus (benannt V1 und V2), die mit einem niedrigen Grad von Affinität zu verbinden, es sei denn, eine Interaktion zwischen ihrer Fusion Partner auftritt. In diesem Fall Einspritzen die beiden geteilten Domains in die funktionale β-Fass-Struktur der Fluorophor (Abbildung 1 b)⁶. Die entscheidende Neuerung des BiCAP stammt aus der Einführung des rekombinanten GFP-gemeinnützige, die eine dreidimensionale Epitop auf dem β-Fass GFP (und Varianten wie Venus) erkennt, die nur auf die korrekt rekombinierte und gefalteten Fluorophor ( vorhanden ist Abbildung 1 b)⁸. Entscheidend ist, bindet die GFP gemeinnützige nicht entweder die einzelnen Fragmente der Venus. Dies erleichtert die Isolierung von Proteinen Dimere erst, nachdem die beiden Proteine, einen Komplex aus eigenem Antrieb gebildet haben, führt zu mehr repräsentative Ergebnisse als die erworbenen aus Methoden, die machen von chemisch induzierten, erzwungene Interaktionen⁹verwenden.

BiCAP ist eine leistungsstarke Technik, die speziell auf Multi-Protein-komplexe, die potenziell können, mit einer Anzahl von downstream-Anwendungen kombiniert werden, die Granularität der unser Verständnis von der Rolle zu verbessern, die diese komplexe in der Signaltransduktion spielen . Es umfasst auch das wichtige Merkmal der Visualisierung von Protein-Interaktionen in Situermöglicht. Bis heute BiCAP als eine wirksame Methode zur Analyse der Interaktom von Rezeptor-Tyrosin-Kinase (RTK) Dimere³nachgewiesen, aber die Anpassungsfähigkeit dieser Methode bedeutet, dass es in fast jedem Protein Interaktion Kontext angenommen werden kann.