绿松石鳉鱼实验室外壳的协议 (Nothobranchiusfurzeri)

鱼在28°c 被上升在水循环系统 (参见水参量), 与 10-20% 每日水处置。三不同的坦克大小推荐: 0.8 升, 2.8 升和9.5 升。每罐接收恒定的水流2毫升/秒。 1. 试剂制备 (不含材料) 注: 非洲绿松石鳉鱼 (Nothobranchiusfurzeri) 可从已建立的实验室库存中提供。每年鳉鱼干燥的胚胎可以通过邮寄方式运送。在 8-30 °c 温度范围内运送胚胎是至关重要的。 在系统水中溶解1克/升腐植酸, 制备腐植酸 (孵化) 溶液。蒸压釜和贮存在4摄氏度, 长达10周。 为制备 HUFA 卤虫浓缩, 每天在盐水虾溶液浓度为500µL/升的盐水虾孵化中加入 HUFA 富集。 在以前的蒸压系统水中溶解100µL/升的亚甲基蓝溶液, 制备亚甲基蓝液。由于亚甲基蓝是光敏的, 保持溶液在黑暗的瓶子, 或覆盖与箔。存储在 RT。 准备椰子纤维作为胚胎孵化的固体基质。或者, 使用过滤纸 (见1.5 节)。 Presoak 椰子纤维用蒸馏水。蒸压釜和贮存在4摄氏度, 长达5周。 在胚胎移植当天, 用湿润椰子纤维制备培养皿。 填充一个90毫米直径的培养皿与椰子纤维下的油烟罩和旁边的火焰, 以减少污染的酵母和细菌。 椰子纤维紧凑, 高度为1厘米, 无菌组织。把大部分的水分从椰子纤维上按在盘子上的纸巾上, 让纸张吸收多余的水。在火焰上加热一个金属勺子, 然后按下整个椰子纤维表面。这可以防止椰子纤维的真菌/细菌污染。 准备过滤纸作为胚胎孵化的固体基质。 在胚胎移植当天, 放置3层过滤纸盘, 适合90毫米培养皿。加入5毫升腐植酸溶液以保持湿度。 2. 育种 鳉鱼绿松石菌的选育注意: 根据这项协议, 性成熟度达到4周后孵化和生育高峰之间 7-9 周。重要的是要注意, 生育力取决于喂养频率和食物质量;因此, 建议至少每天喂养两个饲养池, 以提高胚胎产量 (见5.6 节)。 设置一个9.5 升繁殖罐。填充系统水并添加一条雄性和两只雌鱼。 由于雄性非洲绿松石鳉鱼在交配期间表现出优势, 这可能会导致对雌性的骚扰, 所以选择一个比雌性体型稍小一点的雄性来减少交配压力, 增加生殖产量。成立了5周大的男性, 6/7 周大的女性。 填充一个塑料容器 (10 x 10 x 5 厘米), 蒸压砂达到最终深度为 2-3 厘米, 并将砂箱放在繁殖槽的中心。 让绿松石鳉鱼连续繁殖, 每周收获一次胚胎孵化。注: 使用砂基板对集中式过滤系统构成挑战, 今后应采用替代方法替代。可能的替代方案可能是使用斑马鱼养殖坦克。 转基因育种注: 用于注射的胚胎需要在单细胞阶段同步, 这需要在受精后立即收集。 为了获得用于注射和生成转基因品系的一细胞级胚胎, 建立了一只雄性和两条雌鱼的繁殖槽 (与2.1 相同)。 在胚胎采集前两天, 将雄性单独放在一个水箱中, 并保持雄性与成年雌性的视觉接触。 在收集日, 将雄性和一个沙盒添加到繁殖罐中, 让它们产卵2小时。 3. 胚胎饲养 胚胎采集注: 胚胎采集是通过从砂盒中筛选和收获胚胎进行的。在正常情况下, 每个砂箱应包含从30到200胚胎。 在收集日, 从饲养箱中取出砂盒。将砂箱清空至过滤器 (0.9 毫米应变大小), 并用系统水冲洗。这可以通过一个大的坦克来收集沙子为热处理。 将过滤器部分浸入系统水中, 轻轻旋转, 让胚胎聚集在中心。 用10毫升的巴斯德吸管收集胚胎。 将胚胎移植到90毫米培养皿中, 在40毫升的系统水中。 在光显微镜下检查培养皿中的胚胎, 除去那些呈现破裂的绒毛膜和损伤的迹象。 直接进行胚胎漂白。注意: 每次鱼菌株都要使用一个过滤器, 以防止潜在的交叉应变胚胎污染。 胚漂白注意: 胚胎漂白可防止鱼缸中的微生物污染孵化介质。 漂白前, 使用一次性的巴斯德吸管从含有采集胚胎的培养皿中取出系统水。 为防止不必要的真菌和细菌生长, 将50毫升新制备的 H2O2 (在蒸压系统水中1% 伏/v) 添加到所收集的胚胎中。 在50毫升溶液中, 在90毫米培养皿中以低速速度摇动胚胎5分钟。 将 H2O2解决方案与一次性的巴斯德吸管和洗涤胚胎三次为5分钟与50毫升亚甲基蓝溶液。移除亚甲基蓝溶液。 在蒸压系统水中添加50毫升 H2O2 (1% 伏/v) 到胚胎并摇动5分钟。 删除 H2O2解决方案, 并用50毫升亚甲基蓝溶液清洗三次5分钟。 孵化28°c 的胚胎, 以增加同步胚胎发育, 最高密度为100胚每90毫米培养皿在40毫升亚甲基蓝溶液。注意: 不要在漂白溶液中延长胚孵化。这可能会对鸡蛋绒毛膜造成损害, 并增加胚胎死亡率。胚胎漂白可能会导致鸡蛋绒毛膜的物理化学变化, 可能导致改变绒毛膜生理和孵化成功。 亚甲蓝胚孵化注: 在亚甲蓝溶液中的液体孵化可以防止寄生虫生长, 并能检测死胚和未受精的卵。 检查孵化的胚胎, 从培养皿中除去任何死胚 (由亚甲蓝染蓝), 以防止真菌和细菌污染影响活健康胚胎的生存。 除去旧的亚甲基蓝溶液, 用新鲜溶液代替。 将 Petri 盘返回到28°c 孵化器 (图 1A)。在 7-10 天内, 确保已发育的胚胎显示可见的黑色眼睛。将这些胚胎转移到椰子纤维或过滤纸固体基质介质 (图 1B)。 保留未发育的亚甲蓝胚胎, 每日监测, 一旦黑眼睛发育, 就转移到固体基质培养基中。 重复步骤 3.3. 1-3. 3.3 每天直到胚胎有肉眼可见的黑眼睛。注意: 胚胎对亚甲基蓝的持续暴露可能会导致成年鱼类生理的长期变化。 胚胎移植到过滤纸上注: 绿松石鳉鱼胚可在干燥基质上发育, 综述自然条件。此外, 干胚孵化使研究人员能够同步胚胎和孵化他们在同一天。 随着发育的胚胎在 7-10 天内会有肉眼可见的黑眼睛, 使用一次性的巴斯德吸管或细弯镊子将胚胎从亚甲基蓝溶液转移到先前制备的滤纸板上。 将胚胎与镊子分开5毫米, 每90毫米板可达100个胚胎 (图 1B)。 用 parafilm 封住培养皿。 孵化胚胎在28°c 2-3 周, 直到他们已经完全开发了金色的虹膜, 并准备孵化 (图 1C)。注意: 不要延长孵化胚胎的时间超过2周, 因为它们的生存能力将大大减少。 椰子纤维的胚胎移植注: 蒸压、无菌椰子纤维 (或有机泥炭苔藓) 可用作固体基质孵化的有效替代培养基。 使用一次性的巴斯德吸管或细弯曲镊子将胚胎从亚甲基蓝溶液转移到现成的椰子纤维板上。 将胚胎分布在5毫米之外, 每90毫米板最多100个胚胎 (图 1B)。 用 parafilm 封住培养皿。 孵化胚胎在28°c 2-3 周, 直到他们已经完全开发了金色虹膜 (例如在图 1C)。注: 对于长期贮存 (最多一年), 在3天后从亚甲基蓝溶液到17摄氏度的固基板上转移胚胎。孵化胚胎直到它们发育成黑色的眼睛。 4. 孵化绿松石鳉鱼 注: 绿松石鳉鱼胚胎可以成功孵化在腐植酸溶液14中. 使用细弯曲镊子, 仔细转移 50-100 开发的胚胎进入孵化盒填充的腐植酸溶液在4摄氏度。腐植酸溶液由系统水中的1克/升腐植酸组成。蒸压釜和贮存在4摄氏度, 长达10周。要确保所有的胚胎都完全浸入。腐植酸溶液必须浅, 不超过2厘米。注: 腐植酸溶液的低温改善孵化和完全浸泡的胚胎在解决方案允许同步孵化。 将孵化箱放入28°c 孵化孵化器。用盖子盖住孵化箱。要提供足够的曝气, 用油管与供气连接孵化箱。注: 在孵化过程中没有足够的曝气导致高率的鱼苗无法填满气体膀胱 (“肚皮滑块” 表型, 见5.1 节中的说明) 从孵化后的次日起, 在孵化箱中保持足够的水质, 每天加蒸压水系统的比例为 1:1, 保持最后深度2厘米。 将孵化胚胎转移回固体基质, 并在一周后尝试孵化。注: 孵化后, 绿松石鳉鱼很容易吸收和食用活食物。为最佳生长, 饲料鱼苗每天两次与过剩新鲜孵化盐水虾 (卤咸藻)。充分饱足的标志是橙色的腹部后, 每喂养 10-15 分钟。每天用巴斯德吸管抽出多余的、吃剩的和分解过的盐水虾。 5. 饲养幼鱼和成年鱼类 孵化后五天, 将幼仔移至水循环系统。使用一次性塑料吸管 (或塑料勺), 小心地转移每 0.8 L 坦克配备400µm 油炸屏幕 (图 2) 的五青少年。注: 有可能部分少年鳉鱼不会填满气膀胱, 导致典型的 “腹部滑块” 表型, 其特征是鱼没有达到适当的浮力, 迫使他们连续游泳, 造成严重畸形成年鱼。这些鱼不能用于生存化验或有效育种, 需要被审查。 每日两次喂养幼鱼, 新鲜孵化的盐水虾超过14天后孵化。每天从每罐底部抽出碎片。 在14天的年龄, 转移幼鱼到2.8 升坦克配备了850µm 油炸屏幕。从这一点开始, 标签每个坦克与鱼的 ID, 表明舱口日期, 应变信息, 鱼类性别和鱼类识别号码 (图 3)。为生存化验, 单独地房子每条鱼在单坦克从这一点开始。 在接下来的7天里, 每条鱼用2毫升的盐水虾每天喂两次幼仔。在这个阶段鱼可以补充与 1-3 活的血液蠕虫 (如果血液蠕虫幼虫是太大为鱼, 砍他们入更小的片断用剃刀刀片)。为防止水质恶化, 每周抽出两次吃剩的食物和额外的废物。 从孵化3周后, 从罐体背面取出油炸筛, 每天两次喂鱼2毫升盐水虾和0.5 毫升的血蠕虫。在这个阶段, 青少年应该达到1厘米的身体大小, 应该能够摄取全尺寸的血蠕虫。 在4周的年龄, 每条鱼每天两次喂养2毫升的盐水虾和1毫升的血蠕虫。雌性可以被共同安置在密度高达3女性每 2.8 L 坦克。 在这个阶段确保鱼达到完全性成熟。检查是否存在大背, 肛门和尾鳍的迹象, 男性和圆形腹部满卵的雌性。注: 在单个贮罐中饲养成年鱼以进行生存队列研究可能对鱼类的行为和健康产生负面影响。然而, 群体住房的生存队列研究增加了重要的混杂因素, 由于建立社会优势和男性领土, 导致严格的社会等级制度。 6. 喂养 注: 实验室绿松石鳉鱼可喂养婴儿盐水虾 (卤虫藻幼体) 和血蠕虫 (摇幼虫) 的组合.绿松石鳉鱼鱼苗只喂养婴儿盐水虾。幼鱼和成年鱼类每天喂两次盐水虾和血蠕虫 (图 2)。理想情况下, 鱼可以每天喂食多次, 超过本议定书所示的2喂养。 盐水虾养殖 将10升反渗透 (RO) 水和350克红海盐添加到盐水虾孵化中, 用曝气管曝气溶解。 用5毫升高不饱和脂肪酸 (HUFA) 来丰富培养。 在孵化液中加入20克盐水虾囊肿。检查盐水虾囊肿不漂浮在水面上, 并确保适当的氧合和循环的文化。注: 每日整除数的干盐水虾囊肿可储存在4摄氏度。 第二天下午, 供应的文化与另一整除5毫升的 HUFA。 收获孵化的盐水虾注: 从起动培养到36小时后, 盐水虾就可以收割 (二龄期)。 收集 5 L 的文化在一个容器中使用水龙头底部的孵化器, 让坐10分钟。 10分钟后, 从5升容器的顶部除去盐水虾壳 (棕色), 并通过网格过滤孵化的盐水虾 (橙色)。注意排除在容器底部发现的沉淀物, 因为它含有非孵化蛋和死盐水虾。 用 RO 水将孵化后的盐水虾冲洗成2升的容器, 让它坐10分钟。 10分钟后, 再用滤网过滤盐水虾, 并在2升的 RO 水中采集。 重复前三步骤, 直到盐水虾解决方案没有孵化囊肿和盐水虾壳。 将盐水虾从2升容器中转移到挤瓶中进行喂养。注: 养殖盐水虾是相当健壮和可靠的。但是, 为了避免盐水虾在孵化失败的情况下短缺, 可以使用较小的 (500 毫升) 备份 hatchers。 设置备份孵化器 用曝气法将17.5 克的红海盐溶解在500毫升的 RO 水中。 以500µL 的 HUFA 丰富文化。 加入2克盐水虾囊肿。 在 18-24 h 以后, 再供应文化以500µL HUFA。注: 盐水虾准备在24小时后收割。 活血蠕虫的制备 在喂食之前, 用 RO 水过滤适量的血虫。注: 活血蠕虫可以储存在4°c 7-10 天。 用少量的 RO 水将血蠕虫冲洗成塑料容器。 用一个塑料巴斯德吸管 (狭窄的尖端去除), 拿起血液蠕虫混合物喂养。注: 用来自联合国控制源的活食物喂养实验室鳉鱼菌落增加了来自寄生虫和潜在致病微生物群落的外部污染物的风险。今后应开发一种特殊的不育鱼饲料。 7. 鳉鱼实验室菌株基因分型 注意: 为了区分绿松石鳉鱼菌株, 以及确定每个菌株中的性别, 可以使用特定的基因 (微卫星) 标记 9 ( 表1)。 采样 把鱼牢牢地放在湿海绵顶部的网中。 拭子 2-3 鳞片从鱼体从笼盖到尾翅使用棉签。 在含氢氧化钠溶液的1毫升管 (200 µL 0.5 摩尔/L 氢氧化钠, 1% β巯基乙醇, 0.5% 聚乙烯醇吡咯烷酮) 中, 选取从拭子中提取的鳞片并转移 2-3 鳞片。 在十五年代旋转 PCR 管以确保鳞片完全浸入氢氧化钠溶液中。 基因组 DNA 分离 在95摄氏度孵化样品20分钟。 冷却在 RT, 中和样品以1/10 容量 1 M 三 HCl, pH 8.0。 以全速离心样品5分钟。 8. 水参数 注: 在目标物种的整个生命周期内, 其预期用途为成人分型的生物体的畜牧业需要高度稳定的畜牧业条件。因此, 培养水生生物, 如绿松石鳉鱼, 必须严格控制水的参数。水循环, 再加四步水过滤, 确保了可靠的基础, 以达到对水参数的控制, 提供所有的水箱, 随着时间的推移相同的水条件。建议将系统水从反渗透 (RO) 水中重新使用, 并加入商业海水盐和碳酸氢钠。 水循环系统方案: 第一, 从鱼缸中流出的废水通过固体微粒金属过滤器来捕获所有未被吃掉的食物碎片和更大的微粒。金属过滤器每周冲洗三次;其次, 在第一次机械过滤后, 水被输送到大污水坑中, 然后注入到生物滤池中, 细菌将氨转化为亚硝酸盐和硝酸盐;第三, 从生物滤池中, 水被泵送到 25-µm 过滤套管, 它可以捕获更细的颗粒。最后, 水流经紫外线 (紫外线) 灯, 从细菌和病毒中消毒水。经过这四步, 过滤后的水返回到鱼缸。 为了减少微生物在水箱中的生长, 防止硝酸盐积聚, 降低总盐度, 每天处理 10-20% 的系统水。 保持水温恒定在28摄氏度, 水 pH 常数在7.0 到7.5 范围内。 虽然鳉鱼容忍广泛的盐度, 以避免 oodinosis, 保持电导率范围内 650-710 微西门子。一年长达12小时的光/暗循环确保了群体的健康和生产力。注: 鳉鱼可耐受1500微西门子的水电导率。