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Immunologie und Infektion

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

Published: December 09, 2017
doi:
10.3791/57061
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program,University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences,University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

遺伝コードの拡張は、タンパク質アセチル化を含む、生物学的プロセスの広い範囲を研究するための強力なツールとして機能します。均一に生成するためのこの手法を悪用する安易なプロトコルをアセチル化したタンパク質の大腸菌細胞の特定のサイトを示します。

Abstract

ポスト翻訳の修正蛋白質の特定の位置で発生するさまざまな細胞プロセスで重要な役割を果たすに示されています。その中で、リバーシブルのリジンのアセチル化の一つです最も広く分散の生活のすべての領域でさらに多くの acetylome の質量分析を用いた研究が行われているが、これらの推定のアセチル化ターゲットの特性は制限されています。1 つの可能な理由はほとんどの古典的な生化学的アプローチによって目的の位置でアセチル化された純粋なタンパク質を生成する難しさ。この課題を克服するために遺伝コードの拡張手法が適用されて翻訳共役の設立を指示するペア組み換えピロリジル tRNA 合成酵素バリアント、およびMethanosarcinaceae種からの同種の tRNA を使用するには興味の蛋白質の特定のサイトで acetyllysine のヒストンのアセチル化の研究では、最初のアプリケーションの後、このアプローチは、様々 なタンパク質のアセチル化研究を促進しています。この作品では、ホストとしてモデル細菌エシェリヒア属大腸菌を用いた site-specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコルを示した。リンゴ酸脱水素酵素は、この作品での実証例として使用されました。

Introduction

タンパク質の翻訳後修飾 (Ptm)、翻訳プロセスの後、遺伝子を含むほぼすべての生物学的プロセスに重要な役割を果たすアミノ酸残基を官能基の共有結合の付加から発生します。転写、ストレス応答、細胞分化、代謝1,2,3。までに、約 400 の特徴的な Ptm は識別された4をされています。ゲノム、プロテオームの複雑さとローカライズ、およびタンパク質の活性を調節する蛋白質、核酸、脂質、補因子5など他の分子との相互作用に影響を与えるタンパク質 Ptm によってかなりの程度まで増幅されています。

タンパク質アセチル化は最後の二十年6,7,8,9,10、11,12Ptm 研究の最前線にされています。リジンのアセチル化最初発見されたヒストンで 50 年以上前1314,,も精査されている、80 以上の転写因子、規制当局、および様々 なタンパク質15に存在する知られています。 16,17。タンパク質アセチル化に関する研究だけでなく、その規制メカニズムのより深い理解を提供してくれました、またガイド数機能不全のアセチル化18,19,によって引き起こされる病気のための治療20,21,22,23. リジンのアセチル化は、真核生物でのみ発生が、最近の調査示したタンパク質アセチル化はまた細菌の生理学、走化性、耐酸性、活性化、安定化など重要な役割を果たしていると考えられていた病原性島と他の病原性関連蛋白質24,25,26,27,28,29。

サイト指示された突然変異誘発にリジンのアセチル化の生化学的特徴を一般的に使用されるメソッドで使用します。グルタミンは、同様の大きさと極性のため acetyllysine の模倣として使用されます。それは生理学的な条件の下で、正の電荷を保持がアセチル化されることができないので、アルギニンがリジンのアセチル化非模倣として活用されています。ただし、両方の模倣は実際ジペプチドイソ スターではない、常に30の期待どおりの結果を得られない。最も厳密なアプローチは、困難または不可能自然7,11にリジンのアセチル化の低い化学量論のための最も古典的な方法である特定リジン残基のアセチル化均一蛋白質を生成することです。この挑戦は組み換えピロリジル tRNA 合成酵素を採用し遺伝コードの拡大戦略で解明されてしている tRNA を充電するMethanosarcinaceae種からバリアントと acetyllysine、Pyl利用ホスト並進機械、UAG を抑制するため、mRNA のコドンを停止し、ターゲット蛋白質31の設計位置に acetyllysine の設立を指示します。最近、我々 はこのシステム改善の EF-Tu 結合 tRNA32とアップグレードされた acetyllysyl tRNA 合成酵素33を最適化してきました。さらに、リンゴ酸脱水素酵素34とチロシル tRNA 合成酵素35のアセチル化研究のこの強化された定款システムを適用しました。ここで、実証例として広く検討したリンゴ酸デヒドロゲナーゼ (MDH) を使用して、生化学的同定分子クローニングから純粋なアセチル化タンパク質を生成するためのプロトコルを示す.

Protocol

1 ターゲット遺伝子のサイト指示された突然変異誘発 注: MDH は T7 プロモーター CloDF13起源とコピー数 20 に 4034 pCDF 1ベクトルで表されます。 プライマーによって遺伝子の位置 140 黄色停止コドンを導入 (プライマーを転送: GGTGTTTATGACタグAACAAACTGTTCGGCG、逆プライマー: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC)、サイト指示された突然変異誘発…

Representative Results

アセチル化 MDH タンパク質の収量野生型 MDH のあった 1 L 文化あたり 31 mg 1 L 文化あたり 15 mg であった。図 1に示すように、浄化された蛋白質は SDS のページによって分析されました。野生型 MDH は34の肯定的な制御として使用されました。成長媒体の細胞の acetyllysine (AcK) 設立システムと変異mdh遺伝子から、AcK を返さずを?…

Discussion

NcAA 充電 tRNA によって割り当てられたコドン、ほとんど黄色停止コドン UAG36,37,38,39, の抑制をに基づいて遺伝的非カノニカル アミノ酸 (ncAAs) 定款対応するアンチコドンを含みます。UAG コドンはリリース要因-1 (RF1) 細菌の認識として知られている、それも抑制できる標準的なアミノ酸 (cAAs) によっ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH (AI119813)、アーカンソー大学からスタートアップとアーカンソー生物科学研究所から賞によって支えられました。

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking
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Referenzen

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. . Posttranslational modification of proteins : expanding nature’s inventory. , (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science’s STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?. The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O’Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O’Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O’Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O’Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

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Site-specific AcetylationProtein AcetylationGenetic Code ExpansionPyrrolysyl-tRNA SynthetaseAmber Stop CodonE. Coli ExpressionSite-directed MutagenesisAcetyllysine Incorporation

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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).
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