合成生物学使蛋白质的工程具有空前的特性, 使用非规范氨基酸的共平移插入。在这里, 我们介绍了如何一个光谱红色转移变种的 GFP 型荧光与新的荧光光谱性质, 称为 “金” 荧光蛋白 (GdFP), 是产生于大肠杆菌通过选择性压力成立 (SPI)。
荧光蛋白是生命科学的基本工具, 特别是活体细胞的荧光显微镜。虽然从水母维多利亚(avGFP) 和其他物种同系物的绿色荧光蛋白的野生型和工程化变种已经覆盖了大部分的光学光谱, 但在近红外区域仍然存在光谱缝隙,哪些 avGFP 的显影是不可用的。红移荧光蛋白 (FP) 变体将极大地扩大多分子物种光谱分解的工具箱, 但从珊瑚或海葵衍生出来的自然发生的红移 FPs 具有较低的荧光量子产量和比 avGFP 变体差的照片稳定性。生色的共轭系统对远红色光谱区域的进一步操纵和可能的扩展也被基因代码规定的20标准氨基酸的汇辑所限制。为了克服这些局限性, 合成生物学可以通过将非规范氨基酸插入生色三合会, 进一步实现光谱红移。我们描述了 SPI 在设计具有新的光谱性质的 avGFP 变型的应用。蛋白质表达在色氨酸-auxotrophic 的大肠杆菌菌株中进行, 并通过适当的吲哚前体补充生长培养基。在细胞内, 这些前体被转化为相应的色氨酸类似物, 并被核糖体机械纳入蛋白质中, 以响应该密码子。avGFP (ECFP) 的增强的 “青色” 变体中的 Trp-66 替换为电子捐赠的 4-aminotryptophan 结果 GdFP 具有 108 nm 转移和强烈红移发射最大值 (574 nm), 而热力学上更稳定比它的前辈 ECFP。用质谱法分析了非规范氨基酸的残留特异性。GdFP 的光谱特性以时间分辨荧光光谱为特征, 是基因编码 FPs 在生命科学中的重要应用之一。
自从 1962年1和 1994年2在其他真核细胞中的第一个异基因表达在水母水母维多利亚(avGFP) 中发现绿色荧光蛋白, GFP 家族的荧光蛋白就成为生命科学中非常有价值的工具和目标。广泛的遗传和分子工程学包括调整特定种类的密码子使用, 加速折叠, 改进成熟, 提高亮度, 防止齐聚和调整光谱和光化学性质包括可逆 photoswitch3,4,5,6的能力。GFP 的荧光来自其 4-(p-hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-一 (HBDI) 生色。后者是 autocatalytically 形成的所谓的生色三联氨基酸 (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 在 avGFP) 后形成了额外的共价键在肽骨干内的影响下的分子氧7。共振稳定共轭系统动态地与它的分子环境相互作用, 允许吸收在可见光范围和特征绿色荧光的这些蛋白质。
在生色三合会内, 芳香氨基酸的存在是强制性的。然而, 标准氨基酸汇辑仅包括四芳香残留物 (他的, Tyr, 激进党和的)。这限制了传统的诱变方法, 实现了相对于最红移的自然 FPs (如 DsRed8 ) 从Discosoma 白芨coralimorphs 或 mKate/mNeptune9到更大程度上更红移的 avGFP 变体。海葵Entacmaea quadricolor。因此, 600 纳米以上的光学光谱的远红色和近红外部分是由 GFP 变体所覆盖的。当然, 这是一个严重的限制, 荧光显微方法需要的光谱解复用的几个荧光物种的同时。例如, 长波长标记也是必要的, 利用皮肤组织的低吸收制度在 700-1, 000 毫微米在设置为深部组织成像10。
从 avGFP 中提取的荧光蛋白根据其染色体11的光谱性质和化学性质分为若干类。与它的三合会 Ser-65/Tyr-66/Gly-67, 狂放的类型生色存在作为平衡混合物在中性, 酚醛形式之间 (λmax = 395 毫微米, ε = 2.1万 M-1cm-1) 和阴离子苯酚形式 (λ最大= 475 毫微米, ε = 7100 M-1cm-1), 发射光谱呈 508 nm 的单一峰值。Ser-65 的羟基是至关重要的, 因为它向生色附近 (距离: 3.7 Å) 的 Glu-222 捐赠了一个 H 键, 促进了这种羧酸的电离。类 I 的特点是阴离子苯酚生色, 如在 EGFP (Phe-64-Leu/Ser-65-Thr; λmax = 488 毫微米, ε = 35600 M-1cm-1, λem = 509 nm)。由于 65 (甘) 取代, 中性苯酚的 395 nm 激发峰值被抑制, 阴离子苯酚的 470-475 nm 峰值为五-六倍增强, 并转移到 490 nm。第二类是含有中性酚生色的蛋白质, 如蓝宝石-GFP。在这里, Thr-203-Ile 替代几乎完全压制 475 nm 激发, 只留下峰值在 399 nm。由于阴离子生色不能正确溶解, 所以它的中性形式受到青睐。第三类包括 “黄色” 荧光变体 (EYFP;Ser-65-Gly/Val-68-Leu/Ser-72-Ala/Thr-203-Tyr;λmax ε = 514 nm, ε = 84600 M-1cm-1, λem = 527 毫微米) 与一个芳香的边链子和苯酚的π堆叠相互作用, 由 203-他 (激进党,, Tyr) 替换带来, 导致20毫微米红色转移的发射极大值 (Thr-203-Tyr)。进一步替换 (Gln-69-Lys) 导致另外1-2 毫微米红色转移到529毫微米, 最红色被转移的 avGFP 变形已知11。酚的交换为吲哚 (Tyr-66-Trp) 创造 IV 类, 如在青色荧光 ECFP (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 毫微米, ε = 24800 M-1cm-1; λmax2 = 452 毫微米, ε = 23600 M-1cm-1;λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm)。大量的吲哚的容纳可能是由其他补偿性突变所启用的。ECFP 的激发和发射最大值下降 inbetween 蛋白质的中性或阴离子染色体。V 类蛋白将咪唑置于苯酚 (Tyr-66-His) 的位置, 如 EBFP 的蓝色荧光蛋白. VI 类是由苯酚-苯基交换产生的, 只偏向中性生色形式, 从而导致最蓝移的激发和发射峰值位置 (分别为 360 nm 和 442 nm)。
经典的站点定向诱变特别适合生产新的 avGFP 生色变种, 由65-67 三肽的置换和相互作用的残留物在20规范氨基酸框架。当在核糖体蛋白合成过程中引入非典型的芳香氨基酸变体时, 这些可能性可以进一步扩大12。原则上, 有两种方法来实现这一点。第一种策略依赖于蛋白质翻译机械的基体耐受性, 特别是氨酰-tRNA 合成酶系 (aaRSs) 对相关氨基酸类似物的依赖性。为了高效地实现这一目的, auxotrophic 的大肠杆菌表达菌株无法合成相应的天然氨基酸。这可以通过在培养基中加入适当的非规范氨基酸 (ncAAs) 或前体来替代后者。这个策略, 也称为选择性压力合并 (SPI)13,14, 启用了特定于残滓的替换, 这导致了 ncAA 的全球合并。第二个策略使用停止密码子抑制 tRNAs, 这是由设计的 aaRS 酶充电的 ncAA。这就导致了帧内停止密码子的系通读, 并允许特定于站点的 ncAA 合并。因此, 这种停止密码子抑制方法 (SCS) 导致了遗传代码15的扩展。通过突变, 一个停止密码子被放置到目标基因在所需的地点。在原则上, SPI 也可以用来创建具有独特的 ncAA 安装的重组肽和蛋白质, 考虑到罕见的标准氨基酸, 如满足或跨国激进分子选择替代。通过跨国激进党, SPI 方法已被证明与大量的类似物, 包括 4 F, 5-f 和 6 f-跨国激进党, 7-aza-跨国激进党, 4-oh 和 5-oh 跨国激进党, 以及 4, 和 5-NH2-跨国激进党或甚至β (thienopyrrolyl) 丙氨酸衍生物16 ,17,18,19,20。因此, SPI 可能是非常有利的取代芳香氨基酸的 GFP 染色体的非规范变体, 以探索进一步调整光谱和斯托克斯转移这些 FPs 的可能性。对于所有蛋白质序列的修改, 必须对与 FP 折叠和生色成熟的相容性进行实验测试。
在这项工作中, 我们利用 IV 类 ECFP21, 它运载而不是野生类型的 avGFP Tyr, 在其生色三合会内的一个激进分子残留物。使用 SPI, 这种 Trp-66 (和 Trp-57, ECFP 中唯一的其他的激进党残留物) 被 4-氨基跨国激进党取代。在生色中, 4-氨基跨国激进党的电子捐赠氨基酸群的存在, 有利于一个远红色转移的激发态质子转移 (ESPT) 的共振镇定, 赋予了 108 nm 转移。这种 “金” 荧光蛋白 (GdFP) 构成的变种与最大的红色转移的荧光最大值 (574 毫微米) 之间的所有 avGFP 衍生蛋白。我们描述了 SPI GdFP 蛋白生产的方法, 并提供了通过质谱对产生的修饰蛋白进行强制性分析的协议。此外, 我们还展示了如何利用和分析 GdFP 的时间分辨荧光光谱方法。
为了实现非常高的 ncAA 整合效率, 基于 auxotrophy 的 SPI 方法依赖于新陈代谢工程的宿主细胞, 它们无法合成 ncaa 的相应自然对应物。对于大肠杆菌, 这种菌株是容易获得的。使用 multiauxotrophic 菌株, 即使同时将多种 ncAAs 加入同一蛋白质中也是可行的。残留物的替代模式和化学汇限量被限制在类似的化学类比可以被视为缺点。然而, 由于天然细菌翻译器具容忍许多氨基酸类似物, 大量的蛋白质变异可以被生产。例如, 使用体外翻译可以将超过 50 ncAAs 合并到蛋白质中, 将遗传代码的所有密码子中约73% 用于重新分配40。此外, SPI 还可以允许有效的多站点标记目标蛋白41。原则上, SPI 方法不限于大肠杆菌, 但可以在任何其他宿主和标准的20氨基酸中工作, 前提是 auxotrophic 菌株和定义的培养培养基可用。例如, 两个蛋氨酸类似物, azidohomoalanine (哈) 和 homopropargylglycine (Hpg), 是商业上可用的, 用于标记蛋白质和蛋白质组在不同的有机体。此外, 阿哈可生产 intracellularly, 并随后纳入蛋白质42。这是特别适合 bioorthogonal 动词, 如单击化学开发的 Tirrel 和同事: 例如, 在植物组织的拟南芥, 在蚕森幼虫43,果蝇单元格44, 幼虫斑马鱼45并且哺乳动物细胞包括神经元46, 蛋白质可以被标记与阿哈47,48。类似地, 在跨国激进分子-auxotrophic球菌球菌菌株49中成功地将多党类似物纳入抗菌肽。SPI 对于 Xenobiology50、51的字段也很有用, 它探索了生命基本化学组成的替代方法。例如, 基于以前在大肠杆菌52和B. 枯草53上的工作, 一个大肠杆菌菌株是最近开发的一种具有选择性压力的进化策略, 利用 thienopyrrole 而不是吲哚, 导致蛋白质组广泛取代色氨酸由 thienopyrrole-丙氨酸在遗传代码54。通常, 由单三重编码的标准氨基酸跨国激进分子, 由于吲哚化学的丰富方面, 为蛋白质工程提供了一个有希望的目标, 它具有多种化学变异。最近, 作为一个替代 SPI 为基础的合并, 一个新的 SCS 平台, 能够结合跨国激进的类似网站-特别是在细菌和真核主机已报告了55。这进一步拓宽了在体内基于 ncAA 的蛋白质工程的工具箱, 包括光谱特性的改变。
除了使用 auxotrophic 表达主机, SPI 协议要求严格的发酵条件, 无论是在目标表达时间和培养基的组成, 以达到高 ncAA 的整合效率和目标蛋白质产量56. 耕种是使用化学定义的极小的媒介, 根本上包含除主要盐以外的来源为氮气 (铵盐) 和碳 (d-葡萄糖), 维生素和微量元素。虽然没有严格要求在没有进一步的 auxotrophies, 剩余的氨基酸 (20-n, 如果n氨基酸将被替换) 通常被增加促进细菌成长57。在诱导目标蛋白表达前的初始生长阶段, 将被替换的n规范氨基酸添加到限制浓度中。细胞生长一直持续到被靶向的必需氨基酸耗尽为止, 这是一个固定 OD600所表明的实验结果。随后, 培养基被新鲜培养基所取代, 缺乏枯竭的氨基酸, 并包含了全国体育协会在丰富的浓度。对于色氨酸类似物的核糖体合并, 如本协议所示, 一个吲哚模拟被喂食, 成为 intracellularly 转化为相应的色氨酸合成酶58。其次, 诱导靶蛋白表达。在这个阶段, 细胞接近于对数生长的末端, 作为总细胞数和健身之间的平衡。由于标准氨基的存在和加入会导致野生型蛋白的产生, 所以在诱导前必须保证必需氨基酸完全耗尽是至关重要的。同样, 它是强制性的检查的效率, ncAA 纳入目标蛋白, 通常通过质谱。在典型氨基酸的大量存在情况下, 需要对培养条件进行调整,例如, 通过改变基本氨基酸在初始生长阶段的浓度或后者的持续时间。如果对 ncaa 的 aaRS 活动很低, 则可以进行59, 以表达不同 aaRS 的内生酶或共同表达, 这对 ncaa 更积极。
典型氨基酸多党具有三显著特征: (i) 其蛋白质的自然丰度低;(二) 其生物物理和化学性质是独一无二的 (e. g), 它通常是蛋白质和肽的内在荧光的主要来源, (iii) 它有助于各种生物化学的相互作用和功能, 包括π叠加, H 键合和阳离子π相互作用。所有这些特征都发生了根本性的变化, 在跨国激进党→ 4-氨基跨国激进党替代 GdFP. 毫无疑问, “金” 类 avGFPs 的设计是工程定制 autofluorescent 蛋白的一个显著的例子。有了独特的光谱特性, FPs 可以通过诱变和 ncAA 的结合, 对某些光谱窗口进行调谐。在 GdFP 的情况下, 这是由一个简单的化学交换 H → NH2在 ECFP 生色三合会内的吲哚环的框架内完成的。图 5显示了 ncAA 在生色中的合并效果。引入由 4-氨基吲哚 (intracellularly 转化为 4-氨基跨国激进党) 的电子捐赠组, 使各种中介结构能够解释稳定的激发态。Spectroscopically, 其扩大的斯托克斯转移和红色转移荧光发射结果从这些明显的性质的延伸共轭系统。如前所述, 在 GdFP 生色内的增强内分子电荷转移本质上是对 pH 值 (图 4B) 的敏感, 并且伴随着 s0地面和 s1兴奋状态之间偶极矩的较大变化。相对于 ECFP33。作为替代的电子捐赠组, 在与模型蛋白 barstar41的比较研究中, 可以使用含羟基团取代的吲哚环的色氨酸类似物。
与 ECFP 和 EGFP (图 3C和 D) 相比, GdFP 的吸收和荧光光谱被拓宽。吸收和荧光带的均匀加宽一般是由生色中的振动模式引起的, 另外, 通过生色与蛋白质60中存在的进一步振动模式耦合。与局部蛋白质环境的耦合是由生色上的电荷所支持的。由于蛋白质结构的不均匀性导致了 vibronic 谱的局部变化, 生色的 vibronic 谱与蛋白质的其余部分之间的耦合是由电荷服务业和中介状态所表示的, 如图 5。这种耦合也支持大斯托克斯移位, 并必然降低荧光量子收益率。与其他红移 FPs 相比, GdFP 甚至表现出改进的蛋白质稳定性和低聚合趋势33,61,62。它不仅不同于其他 FP 变体的颜色, 而且还展示了极大增加的热稳定性和增强的协同折叠33。在加热到60摄氏度时, 其荧光强度至少保持 90%, 而 ECFP 荧光量减少到约30%。在蛋白质中, 芳香氨基酸常常有助于相互作用的侧链网络, 这通常对蛋白质的三级结构有稳定的影响。avGFP 拥有这样一个侧链网络, 包括生色本身, 以及 Phe-165、His-148 和 Tyr-145。这些侧链在 GdFP 结构中不仅相当刚性33, 但重要的是, 它们与生色形成疏水性接触。GdFP 中发现的最突出的新特征是合成生色更接近 Phe-165。此交互是其他已知 avGFPs 中未观察到的功能。由于这两种残留物分别为 3.2-4.5 Å, 因此也可能存在氨基芳香的相互作用。与胺化诱导的生色共振稳定, 这些最有可能稳定这种疏水性氨基酸网络的合作方式。相对于生色的基态, 在激发状态下, 可以支持更有效的内分子电荷转移, 并且至少部分地占 108 nm 移位33,62.
在荧光性能的合理设计中, 预测移位π系统的尺寸增大, 从而产生红移激发波长。这个拇指规则服从于位置66的氨基酸系列导致中性染色体: (λmax = 355 nm) < 他的 (λma x= 386 nm) < Tyr (λ最大= 395 nm) < 跨国激进党 (λ最大= 436 nm)63。在自然界中, 生色共轭系π键的延伸是通过不同的策略来实现的。对于来自Discosoma 白芨的 DsRed, 它由附加氨基酸的集成扩展, 从而将λmax转换为 573 nm64。Anemonia 苏卡达中的 asFP595 (λmax = 595 nm) 的生色是由亚氨基组扩展的, 其π系统65扩大.由于 GdFP 和其他 avFPs 的生色大小相同, 不同的原则必须在扩大的 DsRed 和 asFP595 染色体的范围内产生发射波长。108 nm 的深刻斯托克斯转移归因于 GdFP 生色的独特结构, 揭示了 autofluorescent 蛋白设计中的一个新的物理原理。初步计算 (如62中所报告) 表明, GdFP 的激发态生色的偶极矩大于基态, 与 ECFP 的各自值形成对比。而 GdFP 的偶极矩从 s0状态的 ~ 3 d (德拜) 增加到 s1中的 ~ 15 d, ECFP 生色的变化相当温和 (从 ~ 4 d 到 ~ 6 d)。因此, GdFP 的独特的金黄色荧光是由生色内的大量分子内电荷转移引起的, 它增加了可能的中介结构的多样性 (参见图 5), 允许共振稳定。这减少了排放发生的能量水平。由于偶极矩在励磁作用下的深刻变化, 分子内电荷分离是生色环境静电势变化的主要原因。生色激发后, 周围蛋白质基质依次调整到电荷分布的变化。随后的结构弛豫降低了激发生色的能级, 因为它的电荷传递特性将荧光光谱转移到红色。出于同样的原因, 由于大的斯托克斯移位和 radiationless 过程的提高率, GdFP 的荧光量子产量比 ECFP33减少。
ECFP 和 EGFP 的高量子产量和小斯托克斯转移通常归因于生色的刚性蛋白质环境, 从而降低了自由度, 从而使内部转换有利于激发态的辐射松弛。66. 因此, 更严格的嵌入染色体与剩余蛋白质基质的耦合的分子设计可以作为一个指南, 以产生更远的红色转移的 GFP 衍生物高荧光量子产量。因此, 为了进一步的工程方法, 以产生红移 autofluorescent 蛋白, 扩大的π电子系统和刚性生色结构与弱耦合的蛋白质环境是非常可取的。这种修改也可以直接引入 GFP 为基础的染色体或在生色附近放置所需的 ncAAs。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了德国研究基金会 (“统一的概念在催化) T.F. 和附注, 并由联邦教育和科学部 (BMBF 项目” 热休克 2020 “, WIMIplus 项目 SynTUBio) 支持 F。
Chemicals | |||
4-aminoindole | Sigma-Aldrich | 525022 | |
acetonitrile | VWR | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
agar-agar | Carl Roth | 5210 | |
ammonium molybdate ((NH4)2MoO4) | Sigma-Aldrich | 277908 | |
ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth | K029 | |
biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670 | |
colloidal silica | Sigma-Aldrich | Ludox HS-40, 420816 | |
Coomassie Brillant Blue R 250 | Carl Roth | 3862 | |
copper sulfate (CuSO4) | Carl Roth | CP86.1 | |
D-glucose | Carl Roth | 6780 | |
di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carl Roth | X987 | |
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Carl Roth | P749.1 | |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Carl Roth | 6908 | |
DNase I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
formic acid | VWR | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
glycerol | Carl Roth | 3783 | |
imidazole | Carl Roth | X998 | |
indole | Sigma-Aldrich | I3408 | |
iron(II) chloride (FeCl2) | Sigma-Aldrich | 380024 | |
isopropanol | Carl Roth | AE73.1 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Carl Roth | KK36.1 | |
magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth | 8283.2 | |
manganese chloride (MnCl2) | Sigma-Aldrich | 63535 | |
β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.3 | |
potassium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.3 | |
potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
RNase A | Carl Roth | 7156 | |
sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | P029 | |
sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) | Carl Roth | T879 | |
sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4) | Carl Roth | 0183 | |
thiamine | Sigma-Aldrich | T4625 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris) | Carl Roth | 5429 | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich | 857645 | |
tryptone | Carl Roth | 8952 | |
yeast extract | Carl Roth | 2363 | |
zinc chloride (ZnCl2) | Sigma-Aldrich | 229997 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
amino acids | |||
L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | |
L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | |
L-asparagine | Sigma-Aldrich | A8381 | |
L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | A0884 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
L-glutamic acid | Sigma-Aldrich | G2128 | |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
L-glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
L-histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | |
L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | |
L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | |
L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lab materials | |||
0.45 µm syringe filter with PVDF membrane | Carl Roth | CCY1.1 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | |
conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Luer-Lock syringe 5 mL | Carl Roth | EP96.1 | |
dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000 | Spectrum Medical Industries | Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198 | |
Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA | Macherey Nagel | Protino series, 745410.5 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth | TA19 | |
pQE-80L plasmid vector | Qiagen | no longer available | replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID: 32915 |
protein extraction reagent BugBuster | EMB Millipore | 70921-4 | |
round-bottom polystyrene tubes, 14 mL | Fisher Scientific | Corning Falcon, 14-959-1B | |
Trp-auxotrophic E. coli strain | ATCC | ATCC 49980 | Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mass Spectrometry equipment | |||
mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS | Agilent | Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF | coupled with Infinity LC system |
mass spectrometry data analysis software | Agilent | MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00 | |
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS | Sigma-Aldrich | Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 µm particle size, 10 cm x 2.1 mm | |
HPLC autosampler vials 1.5 mL | Sigma-Aldrich | Supelco 854165 | with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
General equipment | |||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 5427 R | |
cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes | Eppendorf | 5810 R | |
high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption | Microfluidics | LM series with “Z” type chamber | |
peristaltic pump for LC | GE Healthcare | P-1 | |
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system | GE Healthcare | ÄKTA pure 25 L | |
orbital shaker for bacterial cultivation | Infors HT | Minitron | |
UV/Vis spectrophotometer | Biochrom | ULTROSPEC 2100 | |
ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption | Omnilab | Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182 | with MS72 sonifier tip |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescence spectroscopy equipment | |||
ps-pulsed laser 470 nm | Picoquant GmbH | PDL-470 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software | Picoquant GmbH | SymPhoTime 64 | |
time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector | Picoquant GmbH | PML-16C | 16 spectral channels, to be selected by grating settings |
single photon counting software | Picoquant GmbH | SPCM 9.75 | |
global fitting software | Picoquant GmbH | SPC2Glo(R) | |
fluorescence decay data analysis software | Picoquant GmbH | FluoFit program | |
data analysis software | OriginLab Inc. | Origin 9.2 | |
neutral density filter set | Schott | NG1 to NG11 | (400 – 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %) |
488 nm long-pass emission filter | AHF Analysentechnik | AHF-488 | |
quartz cuvette | Thorlabs GmbH | CV10Q1400 | 1 cm pathlength |