Ensayos de flujo laminar para investigar el reclutamiento leucocitario en cultivos de células vasculares y las plaquetas adherentes

Sobre la lesión, inflamación o infección, leucocitos responden rápidamente al patógeno o daños asociada – molecular (PAMPs, humedades), cambiar a un estado activado y salir del torrente sanguíneo a sitios de inflamación y tejido de daños. La capacidad de interactuar con su entorno celular y molecular de los leucocitos es esencial para su correcto funcionamiento como las células inmunes, como resaltado por trastornos genéticos como de deficiencia de adhesión leucocitaria¹. Adherencia del leucocito ha sido objeto de intensa investigación durante las últimas décadas y esto ha derivado en el concepto de la cascada de adhesión leucocitaria en los comienzos del decenio de 1990^2,3. Adherencia del leucocito es iniciada por la captura de selectina-mediada de los leucocitos al endotelio, causando las células a rodar sobre la superficie vascular. Este balanceo permite leucocitos buscar señales migratorias endotelio-limite, por ejemplo, quimiocinas, que inducen la activación de las integrinas. Posteriormente, las integrinas activadas median la Unión a ligandos endoteliales, dando por resultado la detención firme del leucocito. Leucocitos pueden posteriormente preparar a extravasate de arrastre y difusión, antes de penetrar en la monocapa endotelial y transmigrating en el tejido subyacente. El concepto básico de la cascada del leucocito canónico ha permaneció prácticamente sin cambios desde su introducción, con algunos pasos intermedios adicionales⁴. Sin embargo, los mecanismos moleculares exactos y los roles de los jugadores muchos involucrados en el reclutamiento leucocitario no aclarados hasta el momento, y reclutamiento leucocitario sigue siendo un tema importante en el campo de la infección, la inflamación y (auto-) inmune investigación.

Por ejemplo, durante enfermedades inflamatorias vasculares como la aterosclerosis, mayor reclutamiento leucocitario en el desarrollo de placa buque pared unidades. Las placas ateroscleróticas inestables podrían romperse, llevando a la activación masiva de las plaquetas y el sistema de coagulación y posteriormente a la obstrucción de los vasos⁵. Esto puede resultar en resultados cardiovasculares graves como infarto de miocardio o accidente cerebrovascular. Además, denudación endotelial, como ocurre clínicamente, por ejemplo, después de stenting de la arteria coronaria, conduce a una multitud de interacciones de los leucocitos y las plaquetas en el interior de pared expuesta del recipiente (p. ej., componentes de la matriz y liso las células del músculo) y de leucocitos con las plaquetas cubriendo la lesión vascular. Estas interacciones son importantes para el desarrollo de la enfermedad como interacciones de monocito plaquetas podrían conducir la formación de neoíntima^6,7. Además, las interacciones plaquetas leucocitos mediaron por la integrina leucocitaria Mac-1 (α β_M2) y plaquetas GPIbα recientemente han sido identificadas como nuevos controladores de la trombosis en ratones⁸.

Dada la amplia disponibilidad de sangre humana y animal como fuente de leucocitos y plaquetas para la investigación y el amplio espectro de moléculas de matriz aislada y líneas celulares inmortalizadas de leucocito y de origen vascular, es factible simular del leucocito interacciones bajo flujo en un laboratorio de creación, utilizando cámaras de perfusión de flujo especialmente diseñada. Muchas variantes se han diseñado en las últimas décadas, que van de vacío a cámaras de perfusión auta-adhesivo. Todas las variantes tienen en común que la parte inmóvil (p. ej., células vasculares cultivadas o proteínas de la matriz) está montada en una cámara de prueba de fugas más grande equipada con un canal predefinido que permite la perfusión de fluidos sobre la parte inmóvil. Además, avances en la tecnología de moldeo permitieron el desarrollo de soluciones a medida basadas en polímeros de sílice⁹. La viscosidad y la velocidad de flujo de los líquidos perfundidos y la altura del canal principalmente determinan las características de la tensión de esquileo del flujo perfusión dispositivo¹⁰. En este artículo presentamos un método en vitro para estudiar los mecanismos subyacentes de la adherencia, la adherencia y transmigración de leucocitos bajo regímenes de flujo venoso y arterial. La ventaja de los métodos presentados aquí es que se puede realizar utilizando un microscopio de fluorescencia con cámara conectada común y no requieren un experimentadores poseer alto nivel técnico. El ensayo en vitro puede ser manipulado de muchas maneras (por ejemplo, mediante la adición de inhibidores o anticuerpos de bloqueo) y por lo tanto es aplicable en diferentes modelos de inflamación vascular y permite la investigación de la adherencia de funciones de la proteína o la evaluación de compuestos específicos.