鼻膜上皮電位差 (NPD) の標準化された測定

ヒトを対象プロトコルは、すべての参加機関の研究委員会で承認されました。技術を実装する各センターはその機関の人間研究の倫理委員会承認のためにアプリケーションの責任です。 1. ソリューションの準備 ソリューション #1, #2 とプロシージャとストアド敷地内 (表 1) の前に 1 L 単位の基本ソリューションである #3 を準備します。注: アミロライド光に敏感、暗闇の中で保存する必要があります (溶液組成の表 1を参照) (SOP の詳細なソリューション準備11を参照)。 バッファーの pH 7.4 で 0.22 μ m ボトル上部フィルターとフィルターのすべてのソリューション。 #3 ソリューションは、最初にリン酸塩を含む塩を追加、(溶液組成の表 2を参照してください) の結晶化を防ぐためにイオン化できるように。注: 混合のシーケンスは、#3 のソリューションにとって重要です。 これらのソリューションは、4 ° c (3 カ月間安定した) または-20 ° c (6 ヶ月間安定した) を格納します。 NPD のテストの日にエージェントを追加することによってソリューション #4, 5 を準備します。イソプロテレノールは光と酸化に敏感なそれは室温 (4% 減衰 4 ~ 8 ° C で 4 h 以上を示す) 活性を失い。4 ° C でのストア注: ATP は光と酸化敏感 (表 3参照)。 化合物 分子の重量 濃度 (mM) 組成 (g/L) 塩化ナトリウム 58 148 8.58 CaCl2 2 H2O 147 2.25 0.33 KCl 75 4.05 0.3 K2HPO4 174 2.4 0.42 KH2 PO4 136 0.4 0.05 MgCl2 6 H2O 203 1.2 0.24 表 1: 溶液組成。 化合物 分子の重量 濃度 (mM) 組成 (g/L) グルコン酸 Na 218 148 33.26 グルコン酸 Ca 430 2.25 0.97 グルコン酸 K 234 4.05 0.95 K2 HPO4 174 2.4 0.42 KH2 PO4 136 0.4 0.05 MgSO4 7 H2O 246 1.2 0.24 表 2: 溶液組成。 ソリューション ソリューション数 内容 EDC マーク リンガーズ注入 #1/A のソリューション 注射用バッファー内の着信音 リンガーズ 着信音 + アミロライド #2/B のソリューション バッファーに格納された着信音 + 100 μ M アミロライド アミル ゼロの Cl- + アミロライド #3/C のソリューション ゼロの Cl- + 100 μ M アミロライドをバッファリング OCL ゼロの Cl- + アミロライド イソプロテレノール #4/D のソリューション ゼロの Cl- + 100 μ M アミロライド + 10 μ M イソプロテレノールをバッファリング ISO ゼロの ATP + イソプロテレノール アミロライド Cl- #5/E のソリューション 100 μ M の ATP + 10 μ M イソプロテレノール 100 μ M アミロライド ゼロの Cl-バッファー ATP 表 3: ソリューションのリストです。 2. カテーテル 塩ビ、滅菌、単一の使用、2 ルーメン (0.7 mm インナー Ø) カテーテルを使用、ラウンドと滑らかな下肢 (2.5 mm 外側 Ø)、NPD のとりわけ設計されています。 側の穴は、灌流の先端の穴の先端に遠い 2 mm で粘膜との接触をする (ステップ 10.1 参照)。 カテーテルの 2 つのルアーロック接続の 1 つを測定電極と灌流ポンプに他の 1 つに接続します。測定ルーメンとしてブルーに染色チャネルを使用します。10 cm 用各 0.5 cm 間隔でカテーテルをタグ付け。注: デッド スペースは 0.3 mL です。カテーテルの準備これが可能でない場合は、次の 2 つの手順をに従って、上記の手順を使用することをお勧めします。 PE50 と PE90 のカテーテル チューブの等しい (〜 76 cm) 長さをカットします。 シリコン ゴム製管の 1 cm の部分で一緒にこれらを貼ります。25 G 鈍い先端針ぴったり 90 PE チューブの反対側の端に挿入します。25 G 蝶針 snuggly を作るなり、チューブを穿刺しないように PE50 チューブの反対側の端に挿入します。 図 4: NPD 測定用カテーテル。インセット ボックス測定穴にカテーテル先端を示しています。 3. 寒天皮膚ブリッジ (蝶針) とカテーテルの準備 注: 溶けた寒天の操作がやけどを引き起こす可能性があります、これは慎重に行ってください。 100 mL の広口ボトルに #1 の溶液を寒天の 3 g を混合することによって 3% 寒天培地を準備します。溶けるまで電子レンジで寒天を溶かす (透明)。 暖かい寒天で 10 mL の注射器を満たしなさい。 蝶針 (23 G) とマークされたカテーテル内腔後シリンジを接続します。先端に表示されるまでは、寒天を注入します。 少なくとも 10 分のためのクールなことができます。 皮膚橋とカテーテルが完全に満たされた、気泡の自由であるために視覚化を確認します。 4 ° C で解決方法 #1 一括皮膚橋を格納し、1 週間後に使用しないでください。 4. if 使用心電図クリーム 解決方法 1 (1:1、v/v リンガー) 心電図クリームを薄くしなさい。空気の泡がなくなるまで休ませてください。 希薄化後の心電図クリーム 10 mL 注射器を入力します。 マーク ルーメンのカテーテルに注射器を接続し、低い側の穴に表示されるまでゆっくりと心電図クリームを注入します。 カテーテルが完全につぶしと気泡の自由であることを確認します。 5. データ集録システム 注: データ集録システムの一般的なセットアップは、図 5に示すです。 図 5: データ集録システムのセットアップ。Bioamplifier とコンピューターのインタ フェースにパッチアンプ用アダプターの接続、およびパッチアンプ用アダプター11電極接続を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 接続 USB ケーブルでデータ集録システム (材料表) にコンピューターを接続します。 データ集録システムを bioamplifier に接続するには、データ集録システム (フロント) bioamplifier (奥) の出力に入力チャンネル 1 から BNC ケーブルを接続します。 カスタム ケーブル事前入力部分、bioamplifier の前にパッチアンプ用アダプターのネジに接続すると、bioamplifier をパッチアンプ用アダプターに接続します。 電極と接地電極、パッチアンプ用アダプターに接続します。パッチアンプ用アダプターの前面を電極に接続するのに標準的な 2 mm メス-メス コネクタを使用します。注: ポートが凹んでいると 2 mm ケーブルの一方向にのみ適合: 赤測定電極 (鼻カテーテル); を介して患者の鼻を患者皮膚ブリッジ; ブラック参照電極白心電図用電極から接地被写体の肌。 説明されているように、bioamplifier を設定: オフセット: 調整、調整後引っ張られた位置に残すには、アクティブ化をプル電圧: DC;1 mV cal: 中立的な立場。電源: バッテリーを充電するための沖データを収集するにゲイン: 設定 10;帯域通過: LoFreq (外側ノブ): DC;帯域通過: HighFreq (内側ノブ): 1 kHz。ボリューム: オフ。 6 頭段オフセットの調整 SOP11で示されるように、ラップトップとシーケンスのアンプを接続します。データ集録システムをクリックし、(順序がデータ取得のために使用される装置を認識するソフトウェアの重要) ラップトップを切り替えます。 SOP シーケンスに従って頭段オフセットを調整します。 7. オフセット 注: 電気測定システムの安定性を確保するためにテストするいくつかのオフセットがあります。(図 6を参照) 電極のオフセットに参照 (負) 電極と測定 (正極) 一緒に希薄化後の心電図クリームまたは 3 M KCl。 確認、パッチアンプ用アダプター上でゼロ近くにある電位差電極の間に読書。 カテーテルおよび/または皮膚のブリッジのオフセットを設定するには、測定 (正極) と一緒にお風呂にルアーロック鼻カテーテル末または皮膚橋末ルアーロックを配置します。心電図クリーム風呂または 3 M KCL、パッチアンプ用アダプターにゼロに近い潜在的な違いがあることを確認参照 (否定的な) 電極を含むカテーテルのもう一方の端を置きます。 閉ループ オフセットを設定するのには、電極の風呂に鼻腔カテーテルを交換するときに、回路が閉じていることを確認します。閉じたループのオフセット 0 に近い読み取りをチェック mV (‘オフセット’; = ± 2.5 mV)。0 オフセットをさせるパッチアンプ用アダプター オフセット ノブを調整する mV。注: これは回路内のすべての接続されていないことを確認します。鼻カテーテルがそのままできない場合があります、そうでない場合 (寒天または ECG クリームの気泡)。寒天橋を変更またはセットアップで心電図クリームをプッシュします。閉鎖に続いて電極オフセットする必要があります最初に、実行するシステム (閉ループ オフセット) 電極とブリッジ (図 6)。 図 6:(A) 電極オフセット、(B) カテーテル (または橋) のセットアップのオフセット (C) 閉ループ オフセット。 8. 注射器セットアップ 注: 以下は、推奨される設定です。 #1, #2 と #3 ソリューションを融解測定の前に約 1 時間。 カテーテルに最も近い活栓に延長線を接続します。 すべてのポンプに切り替えるし、活栓が泡のクリアまでカテーテルを完全にフラッシュする解決方法 1 でカテーテルをフラッシュします。 9 参照および測定電極の配置 図 7: 電極と皮下ブリッジ測定の準備測定と件名です。 NPD のオペレーターに直面して座位を取る研究主題を持ちます。快適、オプションの帯電防止マットと視能矯正顎残りの頭に足を配置します。 被験者の腕 (図 7) に置かれた心電図のパッドに接地リード電極を接続します。 (寒天システム) の背側の前腕の皮下針の挿入または前腕に以前最小限すりむいた部分にクリーム心電図に参照電極を適用 (ポイントを 10 以下に 7 を参照)。 皮膚 (指 PD) との電位差を測定し、彼/彼女の親指と人差し指の先端間カテーテルをつまんで「測定穴」を閉じるに件名求めて皮下組織への接続を確認します。 指 PD が-30 場合 mV 以上負、蝶針の挿入を確認してください。(心電図クリーム セットアップ) の耐摩耗性を繰り返して、橋をチェックします。 右の鼻孔で 80 mL/h スタートで解決方法 1 シリンジ ポンプを開始します。 安定した負電圧として指 PD を測定 (典型的な範囲-80-40 mV)。 心電図クリーム システムを使用している場合: 心電図クリーム 1:1 の希釈し、寒天の以前に見たプローブ穴からオフの完全なフラッシュ後カテーテルを埋めます。 電極は、電極のオフセット、インセット橋のチェックを許可するを入浴する心電図クリームで半分いっぱい 50 mL シリンジにカテーテルを接続します。 皮膚のわずかな前最小摩耗によって皮下組織に参照 Ag/Cl 電極を接続して、皮膚が表示されます ‘ピンクで光沢のある「真皮のレベルに達する。 位置を測定電極、心電図クリーム、すりむいた皮膚で覆われています。指 PD 寒天培地システムの前に示されているを確認します。 10. 基底 PD の測定 下鼻甲介を視覚化する照明か (または同等) を使用して右の鼻に鼻カテーテルを挿入します。ランドマークとして前方の先端を使用して、事前に下の呼吸器粘膜上鼻甲介の下のサイトを対象とするカテーテル。また、配置が困難な場合、鼻孔の床との接触プローブ穴を配置できます。注: カテーテルはオペレーターによって鼻孔に導かれるには十分に堅いです。配置を容易にするには、カテーテルの 1 つのチャンネルはブルーの色で、下鼻甲介と接触プローブ側の穴が含まれています。これはカテーテルの回転を防ぎます。10 cm に 1 からカテーテルに示されているマークは、簡単に参照ポイントを提供します。 下鼻甲介の PD を測定します。この目的のためには、下鼻甲介 (右基底でマーク) の粘膜に対しての配置によってカテーテルの測定穴が閉じていることを確認します。 0.5 cm (内下鼻甲介から下鼻道の距離)、1.0、1.5 2.0 3.0 で PD を測定: 右基底 PDs をマークします。 約 5 の指定距離で各測定を維持 s はそれぞれが着実な読書 (± 1 mV) を確保するため、基底の PD 値の正確な解釈を容易にします。 左基底 PDs (3 cm、2 cm、等) と、左基底でマークするファンクション キーを使用して、左の鼻孔で上記の手順を繰り返します。 最も否定的な信号のサイトに鼻腔カテーテルのプローブを挿入基底 PD 対策をガイドとして使用して、(下鼻甲介の前方の先端から 3 cm まで)、鼻 (または同等) の先端にテープの小さい部分で固定。 11. NPD シーケンシャル Perfusions トレース 右の鼻の ソリューションは患者さんの鼻から滴り落ちることを確認します。(しばしば主題自分の手で自分の頭を休ませるか、あごや他の固定デバイスを使用することで助けた) を自分の頭を快適な位置を想定して件名を持ちます。動きを最小限に抑え、鼻や、チューブに触れないように話を避けるために、件名を思い出させます。 解決方法 1 をオン (5 mL/分、または 300 mL/h) (着信音) ポンプ。安定した値が得られるまでの記録 (< 1 mV 変更/30 秒)。注: これは、安定性を達成するために約 3 分かかります。 解決方法 1 による血液灌流をオフにします。 解決策 #2 (アミロライド) で灌流を開始します。3 分以上の NPD を記録 (プラトー電圧が疑わしい場合は最大 5 分の合計の記録を継続)。 #3 (ゼロ塩化) ソリューションで灌流を開始します。3 分以上の NPD を記録 (プラトー電圧が安定していない場合は最大 5 分の合計の記録を継続)。 #4 (イソプロテレノール) ソリューションで灌流を開始します。3 分以上の NPD を記録 [プラトー電圧が安定していない場合 (少なくとも 30 の定常電圧トレース < 1 mV ドリフトの s)、合計 5 分までの録画を続ける]。 ソリューション #5 (ATP) を灌流を開始します。1 分、ピーク過分極応答が得られるまでの最低記録 NPD は。 解決方法 1 (着信音) による血液灌流を有効にでき、30 s、カテーテルをフラッシュします。 解決方法 1 血流をオフに。 左の鼻孔の手順を繰り返します。 12. テストの終了 再確認し、5 の安定した指 PD (「ポスト指」) を記録 s。 皮膚挿入部位から被験者の皮膚橋と包帯を削除します。塩化銀/心電図クリーム システム アームから電極を削除します。 前述の初期の閉ループ オフセットを測定するために「最終的な閉じたループ オフセット」電圧を記録 (ステップ 7.1.3 を参照)。 ファンクション キーと最終的なオフセットをマークします。 データ集録を停止 (プレス””を開始)。注: 現在の SOP テスト用ポジティブ コントロールとして、プリン カルシウム依存-の Cl 分泌をアクティブに 100 μ M ATP の使用をお勧めしますただし、これは省略可能なテストです。