단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

1. 초파리 태아 컬렉션 참고: 동일한 배아 컬렉션 이전 게시15와 같이 수행할 수 있습니다. 젊은 eGFP PCNA 파리 전송 (< 1 주 이전) 계란 컬렉션 연습장 yeasted 컬렉션으로 접시16 (1% 에탄올, 1% 초 산, 및 4 %agar). 25 ° c.에 설정 인큐베이터 컬렉션 새 장 이동 부 화 달걀 수집 전에 1-2 일 동안 계란 생산량을 크게 향상 됩니다. 하루에 두 번 컬렉션 접시를 변경 합니다. 30-60 분 간격으로 수집 약 실에서 배아를 포함 하는 접시를 제거 합니다. 작은 간격 발달 단계의 엄격한 배포 하지만 적은 배아 발생. 수집 병렬로 여러 연습장에서 그렇게 하는 이상적으로 > 200 계란 30-60 분 마다 놓여 있다. 배아를 원하는 나이 도달할 때까지 25 ° C에서 접시를 저장. Blastoderm 단계에 대 한 배아 (핵 주기 14), 약 2 시간에 대 한 품 어. 외피의 2 시간 후 추가 수돗물 물 총 병에서 컬렉션 플레이트에 전체 표면을 물으로 덮여 있다. 배아를 일시 중단 하 고 부드러운 브러쉬를 사용 하 여 효 모. 붓고 컬렉션 접시에서 resuspended 배아 배아 컬렉션 바구니 (100 µ m 기 공 크기와 수 제 바구니17 일 잘 상업 세포 멤브레인), 물 총 병에서 추가 수돗물을 추가 필요한 경우. 이 단계에서 동시에 수집 된 모든 접시에서 배아를 결합 한다. 풀링된 샘플은 단일 일괄 처리를 나타냅니다. 잘 물 총 병 30에서 수돗물으로 바구니를 rinsing 하 여 태아를 씻어 s 모든 효 모 찌 꺼 기를 멀리 세척 될 때까지. 물에 2.5% 염소 솔루션으로 컬렉션 바구니를 배치 하 여는 Dechorionate 배아 소용돌이 의해 빛 동요는 chorion의 제거를 촉진 한다. 그들은 바구니 밖으로 해제 및 다시, 빠져들 때 솔루션의 표면에 떠 있도록 배아 충분히 소수 성까지 계속는 ~1.75–2 분 걸릴 한다.주의: 염소 부식성입니다. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 포함 하는 솔루션 < 10% 염소 일반적으로 싱크대에 삭제 수, 호스트 연구소의 규정을 확인 하시기 바랍니다. 솔루션에서 바구니를 제거 하 고 표 백제 냄새는 더 이상 눈에 띄는 때까지 물 총 병에서 수돗물으로 깨끗이 씻어. 2. 배아 고정 참고: 최적의 고정 조건, 세제, 포름알데히드 및 고정, 기간의 주로 농도의 배아 단계에 맞게 실험적으로 결정 될 필요가. 단계 syncytial blastoderm 주위에 대 한 최종 농도 0.5% 트라이 톤 X-100 그리고 1.8% 포름알데히드의 수성 단계에서 잘 작동 합니다. 태아 단계 9 넘어 나중 단계에 대 한 추가 매개 변수 최적화 할 수 있습니다. 고정 및 정렬 하는 동안 사용 되는 모든 솔루션 protease 억제제를 포함 해야 합니다. 컬렉션 바구니를 반전 하 고 15 mL 원뿔 원심 튜브 위에 놓습니다. PBS-T를 분배 하는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 튜브에 바구니에서 배아를 플러시 (PBS, 0.5% 트라이 톤 X-100). 배아 정착 하단에 볼륨을 조정 총 2 mL PBS T와 함께 하 게 물에 헵의 6 mL 및 37% 포름알데히드의 100 µ L를 추가 합니다.주의: 헵 및 포름알데히드 독성 흡입 또는 피부 후 문의. 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 증기 두건에서 작동. 헵 또는 포 름 알 데히드를 포함 하는 폐기물 호스트 연구소의 규정에 따라 별도로 처리할 수 있다. 포 름 알 데히드의 추가 후 15 분 타이머를 시작 하 고 적극적으로 흔들어 튜브 아래로 1 분 동안 직접. 수성 및 유기 단계는 폼 샴푸 같은 일관성을 결합할 것 이다. 교 반 하십시오 회전 믹서에 10 분까지 포름알데히드의 추가 후에. 튜브의 하단에 배아를 수집을 실 온에서 1 분 동안 500 x g 에서 원심. 전체 샴푸 같은 액체를 발음 하 고 어떤 배아를 발음 하지 않도록 주의 복용, 그것을 폐기. 샴푸 같은 상쾌한의 소량 남아 있는 문제가 발생 하지 않습니다. 포름알데히드, 추가 후 15 분은 포름알데히드를 끄다 125 mM 글리신과 PBS-T의 5 mL에 배아를 resuspend. 적극적으로 1 분 대를 위아래로 흔들어 섞는다. 1 분 동안 실 온에서 500 x g 에서 centrifuge 고 상쾌한 발음. 얼음 처럼 차가운 PBS-t 5 mL에 resuspending에 의해 태아를 씻어 배아 정착 및 aspirate 모든 표면에 뜨는 게. 세척 단계 2.10에서에서 두 번 더 반복 합니다. 정렬까지 얼음에 배아를 유지. 일반적으로, 그것은 정렬에 진행 하기 전에 비행 배아의 3-4 일괄 처리를 수집 하는 것이 좋습니다. 그러나, 같은 날 사용 하는 배아 정렬 되어야 한다. 얼음 이나 냉장고에 확장된 저장 변경 된 배아 형태 이끌어 낸다. 3. 배아 정렬 참고: 60-80 X 배율에서 GFP 필터를 갖춘 어떤 형광 스테레오 현미경에 수행할 수 있습니다 정렬. 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 정렬, 어두운 색의 선호에 적합 한 작은 유리 그릇에 약 100 배아의 일괄 처리를 전송 하 고 얼음에 그것을 배치. 핵 밀도 세포 주기 상태 (그림 1) 팁을 바늘 또는 주사기를 사용 하 여 별도 더미에 바람직한 배아를 밀어 여는 정렬 배아 EGFP PCNA (그림 1E)의 분산, 비 핵 분포와 모든 배아를 제거 합니다. 또한, 부분적으로 비 핵 GFP 신호를 표시 하는 배아는 제거 되어야 한다. 정렬에 투입, 핵 주기 12, 13, 그리고 14 가이드로 그림 1 에서 그림을 사용 하 여 각 일괄 처리에서에서 참조 배아의 라인을 조립. 이 라인을 사용 하 여 그들의 단계를 결정 하기 위해 참조 배아 중 알 수 없는 단계의 배아를 일치. 참조 배아에 대 한 발달 단계를 확인 하려면 이미징 태아 및 거리 정보를 제공 하는 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 2, 500 µ m2 의 영역에서 태아의 표면에 핵의 수를 계산 하 여 핵 밀도 측정 합니다.참고: 2, 500 µ m2 의 영역에 대 한 핵의 예상된 번호는 핵 주기 12, 12 ~ 16 핵 및 핵 주기 131320 30 핵. 적절 한 단계에서 모든 배아 분리는 일단 설명서 및 품질 관리에 대 한 배아의 사진을 찍을. 스테레오 현미경 자체 카메라 모듈을 장착 하지 않으면, 어떤 epifluorescence 현미경 GFP 필터와 함께 사용할 수 있습니다. 얼음에 1000 µ L 피 펫, 신선한 관을 전송 사용 하 여 원하는 배아를 플라스틱. 충분 한 태아는 계획 된 실험에 대 한 정렬 될 때까지 계속 합니다. 오래 된 태아에 대 한 9, 무대 보다 일반적으로 20 배아는 안녕 C 실험 한 현장에 대 한 충분 한. 핵 주기 12, 80 배아는 좋은 출발점입니다. 이전 사이클에서 모든 사이클에 대 한 약 배아의 수를 두배로 한다. 1.5 mL 튜브 한 튜브는 단일 위치에 이-C에서에 대 한 충분 한 배아를 포함 하는 방식에서으로 및 분할 배아 실험. 그것은 동일한 관 전체 프로토콜 사용 됩니다 때문에 DNA의 흡착 낮은 DNA 농도에서 상당한 손실을 발생할 수 있습니다 낮은 DNA 바인딩 특성을 가진 튜브를 사용 하는 것이 좋습니다. 잠시 실 온에서 100 x g 에서 튜브를 회전 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 배아를 건조 해야 가능한 동결에 대 한. 플래시는 액체 질소와-80 ° c.에 게 튜브를 잠수 하 여 배아를 동결 4. 제자리에서 안녕-C 세포의 용 해 얼음에 냉동된 배아로 튜브를 놓습니다. 얼음 처럼 차가운 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris Cl pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.2% IGEPAL CA-630, protease 억제제,에 녹은 물)의 500 µ L에 배아를 resuspend. 그런 다음 튜브의 하단에 정착 하는 배아를 1 분 기다립니다. 배아는 금속 마이크로 유 봉, 미리 단단히 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 맞게 설계 된 얼음에 냉각을 사용 하 여 갈아. Agitating 배아를 방지 하려면는 유 봉 천천히 튜브의 바닥 접촉 될 때까지, 아래로 밀어 넣은 다음 두 방향에 (서) 두번 유 봉 회전 하 여 분쇄. 유 봉 아주 약간, 다시, 튜브의 하단에 밀어 들어올린 연 삭 반복. 4.1.3.2 10 번을 반복 하거나 배아는 완전히 lysed. 솔루션 균질 성, 그리고 배아의 잔여 더 큰 조각을 유지 해야 합니다. 1000 x g, 5 분, 4 ° C에서 15 분 회전을 위해 얼음에 무 균된 정지 품 어 고 상쾌한 삭제. 아래로 pipetting 500 µ L 얼음 세포의 용 해 버퍼에서 resuspending으로 펠 릿을 세척. 4.1.4에서 다시 회전 하 고 상쾌한 삭제. 씻어 펠 릿 100 µ L의 0.5% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)에 위쪽 및 아래쪽 pipetting resuspend 열 블록에 65 ° C에서 10 분 동안 배양 하 여 핵 permeabilize. 10% 트라이 톤 X-100 그리고 120 µ L 물 50 µ L을 추가 하 여 SDS를 끄다. 튜브를 터치 하 여 혼합. 열 블록에 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 금지 효소 소화 제한 효소 버퍼 x 10와 20 U 5 U / µ L MboI의 25 µ L를 추가 합니다. 튜브를 터치 하 여 혼합. 약간의 동요 (750 rpm)에서 열 블록에 37 ° C에서 90 분 동안 배양 하 여 DNA를 소화. MboI의 또 다른 20 U를 추가 하 고 90 분 부 화를 계속. 20 분 동안 62 ° C에서 배양 하 여 열 비활성화 MboI 오버행 채우기참고: 특정 합자 조각의 선택을 허용 biotinylated dATP와 오버행에 작성 됩니다. Biotin-dATP unligated 무뚝뚝한 끝에서 효율적으로 제거 하는 반면 결 찰 접속점에 biotin dATP exonuclease 활동의 T4 DNA 중 합 효소 (4.6 섹션)에서 보호 됩니다. 풀 다운 메뉴를 사용 하 여 streptavidin 입히는 구슬 섹션 4.7에에서 따라서 구체적으로 합자, 공상 DNA 파편에 대 한 풍요롭게. Biotin-14-dATP 0.4 m m의 18 µ L, 2.25 µ L의 수정 되지 않은 dCTP/dGTP/dTTP 혼합 (3.3 m m 각), 그리고 5 U / µ L DNA 중 합 효소 I Klenow 파편의 8 µ L를 추가 합니다. 튜브를 터치 하 여 혼합 하 고 열 블록에 90 분 동안 37 ° C에서 품 어. 결 찰 추가 물 657 µ L, 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 10%의 100 µ L의 120 µ L 트라이 톤 X-100, 6 µ L 20 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 그리고 튜브를 터치 하 여 혼합의. 마지막으로 튜브를 터치 하 여 5 µ L 5 U / µ L T4 DNA 리가와 섞어를 추가 합니다. 회전 튜브 부드럽게 (20 rpm) 2 시간 실내 온도에. 5 U / µ L T4 DNA 리가의 5 µ L의 두 번째 할부를 추가 하 고 더 많은 h 2에 대 한 회전 계속. 5 분 동안 2500 x g 에서 핵 아래로 회전 시키십시오 그리고 상쾌한 삭제. DNA 추출 추출 버퍼 (50 mM Tris Cl pH 8.0, 50 m m NaCl, 1 mM (EDTA), Ethylenediaminetetraacetic 산 1 %SDS,에 녹은 물)의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 튜브를 터치 하 여 20 mg/mL 가수분해 K. 혼합의 20 µ L를 추가 합니다. 30 분, 1000 rpm에서 떨고 55 ° C에서 배양 하 여 단백질을 소화. 드-crosslink를 5 M NaCl의 130 µ L을 추가 하 고 1000 rpm에서 떨고 68 ° C에서 밤새 품 어. 우선적으로 낮은 DNA 바인딩 특성을 가진 새로운 2 mL 튜브에 피 펫 샘플. 3 M 15 mg/mL GlycoBlue의 나트륨 아세테이트 pH 5.2와 2 µ L의 0.1 x 볼륨 (63 µ L)를 추가 합니다. 반전 하 여 잘 혼합. 반전 하 여 순수한 절대 에탄올과 혼합의 1.6 x 볼륨 (1,008 µ L)를 추가 합니다. -80 ° C에 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 20000 x g 15 분 원심 분리기에서 품 어. DNA 펠 릿은 종종 아주 작은, 거의 보이지 않는, 그리고 GlycoBlue의 파란 색깔 때문에 발견 될 수 있습니다. 제거 상쾌한 매우 신중 하 게, DNA 펠 릿이 있는 곳에서 반대쪽 벽을 따라 관으로 피 펫 팁을 이동 합니다. 작은 나머지 방울 P10 팁을 사용 하 여 튜브에서 그들을 밀고 하 여이 단계와 다음 세척 하는 동안 종종 쉽게 제거는 pipetting 그들을 밖으로 보다는 오히려. 70% 에탄올의 800 µ L을 추가 하 여 펠 릿을 세척. 반전 하 여 혼합 하 고 원심 20000 x g 5 분에 대 한 실 온에서 반복이 세척 한 번 이상. 에탄올의 모든 흔적을 제거 하 고 건조에 최대 5 분 동안 뚜껑 열고 관 서를 떠나. 일단 아무 액체, 잔여 10 mM Tris Cl pH 8.0의 50 µ L를 추가 합니다. 반복적으로 펠 릿을 solubilize DNA 위치 했다 튜브의 벽에 영역 솔루션 플라스틱. RNase A, 튜브, 터치 하 여 믹스 20 mg/mL의 1 µ L을 추가 하 고 요약 RNA에 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 샘플 지금 냉장고에서 밤새 껏 저장 또는-20 ° C에서 무기한 동결 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 분석 결과 기반으로 하는 형광 염료를 사용 하 여 DNA의 농도 확인 하십시오. 샘플에서 DNA의 총 금액은 적어도 10 이어야 한다 ng, 그렇지 않으면 너무 작은 재료를 사용할 수 확대를 위한 라이브러리 복잡성 가능성이 낮을 것 이다. 이 경우, 시작 물자의 양을 하지 충분 했다, 또는 자료는 세포와 강 수 동안 아마도 도중에, 분실 되었다. Biotin 제거 및 DNA 전단 10 x T4 DNA 중 합 효소 버퍼의 12 µ L, 1 mM dATP의 3 µ L, 1 m m dGTP의 3 µ L 및 물 46 µ L 함께 추가 합니다. 튜브를 터치 하 여 혼합. 3 U/mL T4 DNA 중 합 효소의 5 µ L을 추가 하 고 튜브를 터치 하 여 섞어 30 분 동안 20 ° C에서 품 어. 반응을 중지 하 0.5 M EDTA의 3 µ L을 추가 하 고 사용 하 여 물 샘플 약 120 µ L의 볼륨을. DNA의 200-400 bp 쥡니다 장치 제조업체의 지침에 따라 사용 하 여 크기를 전단 테이블의 자료에 언급 된 sonicator 사용 하 여, 다음 프로그램은 적절 한: 2 주기 각 50 s, 10% 듀티, 강도 5, 200 사이클/버스트. Biotin 풀 다운 새로운 관으로 30 µ L 10 mg/mL 코팅 streptavidin 자석 구슬의 플라스틱, 마그네틱 스탠드에 그들을 분리 하 고 상쾌한 삭제. Vortexing에 의해 B & W 버퍼 (5 mM Tris Cl pH 7.4, 0.5 m m EDTA, 1 M NaCl,에 녹은 물) + 0.1% 트라이 톤 X-100 및 혼합 1 구슬 resuspend. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 제조사와 모델에 따라 구슬 구분 됩니다 때까지 1-5 분 대기 합니다. 발음 하 고 구슬이 있는 곳의 맞은편 벽을 따라 피 펫 팁을 슬라이딩 하면서 상쾌한 삭제. B & W 버퍼 (10 mM Tris Cl pH 7.4, 1 mM EDTA, 그리고 2 M NaCl) x 2의 120 µ L에 구슬 resuspend. Vortexing에 의해 혼합. 새로운 낮은 DNA 바인딩 튜브에 깎인된 DNA를 전송 하 고 120 µ L 2 X B & W 버퍼에 구슬의 서 스 펜 션의 vortexing에 의해 혼합. 15 분 20 rpm에서 DNA 샘플 구슬 회전. 마그네틱 스탠드에 구슬 하 고 상쾌한을 삭제 합니다. Resuspend 비즈 B & W + 0.1% x 1의 600 µ L에 Triton X-100 그리고 1000 rpm에서 떨고 2 분 동안 55 ° C에서 품 어. 분리 후 상쾌한을 삭제 합니다. 이 세척 한 번 반복 합니다. 비즈 10 mM Tris Cl pH 8.0의 600 µ L로 한번 세척 하 고 분리 후 상쾌한 삭제. 비즈 10 mM Tris Cl pH 8.0의 50 µ L에서 resuspend. 5. 시퀀싱 라이브러리 준비 참고: 모든 라이브러리 단계 완료 상업 DNA 도서관 준비에서 구성 요소를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조). 그러나, 다른 장비 또는 다른 약 대체 수 있습니다. 강 수는 냉장고 보관 시 라이브러리 준비 요원에서 형성 하 경향이 있다. 그것은 따라서 모든 강 수는 시 약을 사용 하기 전에 녹는 다는 것을 확인 해야 합니다. 최종 수리 새로운 PCR 관으로 10 mM Tris Cl pH 8.0의 50 µ L에 구슬 정지를 전송 합니다. 최종 준비 효소 혼합의 3 µ L 및 최종 준비 반응 버퍼의 7 µ L를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 튜브 열 cycler에 전송 하 고 다음 프로그램 실행: 20 ° C에서 30 분, 30 분, 및 4 ° c.에 보류에 대 한 65 ° C 어댑터 결 찰 결 찰 마스터 믹스, 1.5 µ M의 2.5 µ L의 30 µ L 추가 시퀀싱 어댑터 (주식에서 1.5 µ m 희석), 그리고 구슬 정지를 결 찰 증강의 1 µ L. 아래로 pipetting으로 혼합. 열 cycler에서 15 분 동안 20 ° C에서 품 어. 사용자 효소의 3 µ L를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 혼합. 열 cycler에 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 마그네틱 스탠드에 구슬 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 씻어 구슬, resuspend 1 x B & W 버퍼 + 0.1%의 100 µ L에서 비즈 트라이 톤 X-100. Vortexing, 및 새로운 microcentrifuge 튜브에 의해 혼합. 마그네틱 스탠드에 구슬 하 고 상쾌한을 제거 합니다. 한 번 같은 버퍼의 600 µ L를 사용 하 여이 세척을 반복 합니다. 비즈 10 mM Tris Cl pH 8.0, vortexing에 의해 혼합의 600 µ L에서 resuspend 그리고 새로운 튜브에 비즈를 전송. 마그네틱 스탠드에 구슬, 상쾌한, 삭제 하 고 10 mM Tris Cl pH 8.0의 50 µ L에 비즈를 resuspend 합니다. PCR 증폭 두 개의 PCR 튜브를 준비 하 고 각, 중 합 효소 마스터 믹스의 25 µ L, 1.5 µ L 10 µ M 앞으로 (인덱싱되지) PCR 뇌관의, 그리고 10 µ M 역 (인덱싱된) PCR 뇌관의 1.5 µ L를 혼합.참고: 전달 (인덱싱되지) PCR 뇌관:5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC * T-3´.역방향 (인덱싱된) PCR 뇌관:5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC * T-3´. * 인덱싱된 PCR 뇌관에 phosphorothioate 채권과 Ns를 나타냅니다. 각 관에서 아래로 pipetting으로 비드 펜션과 믹스의 22 µ L를 추가 합니다. 다음과 같은 프로그램을 사용 하 여 PCR을 실행: 1 분에 98 ° C (15 98 ° C s, 75 65 ° C s, 램프 1.5 ° C/s) 반복 9-12 시간, 5 분 및 4 ° c.에 보류에 대 한 65 ° C참고: 확대 주기의 수는 경험적으로 확인할 수 있다. 그러나, 우리가 발견 이상 12 주기를 요구 하는 라이브러리 낮은 복잡성의 일반적으로 했다이 C 지도 하는 높은 품질을 초래 하지 않았다. 다른 한편으로, 라이브러리 미만 12 주기를 요구 했다 부정적인 영향을 받지 12 사이클 전체에 대 한 증폭. 따라서, 증폭의 12 사이클을 가능 하다. 단일 microcentrifuge 튜브에 두 개의 PCR 반응 수영장, 마그네틱 스탠드에 구슬 고 상쾌한 새로운 튜브를 라이브러리에 포함 된 전송 합니다. 크기 선택 Ampure XP 비드 정지를 가져올 실내 온도 믹스 떨고에 의해 잘. 물으로 정확 하 게 200 µ L 풀링된 PCR 반응의 볼륨을 가져와. PCR 및 자력 분리, 원래 볼륨의 일부는 일반적으로 손실 됩니다. 200 µ L를 피펫으로 설정 하 여 볼륨을 확인 하 고 반응의 전체 볼륨을 발음. 어 발음 하는 경우 더 추가할 필요가 물. 볼륨 200 µ L를 초과 하면 비례 5.4.3, 5.4.6 단계에 추가 하는 구슬의 볼륨을 조정 합니다.참고: 괄호 안에 볼륨은 풀링된 PCR 반응의 총 볼륨은 정확 하 게 200 µ L 경우 유효 합니다. Ampure XP 비드 현 탁 액의 0.55 x 볼륨 (110 µ L)를 추가 하 고 아래로 10 번 이상 pipetting으로 혼합. 5 분, 5 분 동안 마그네틱 스탠드에 별도 구슬에 대 한 실 온에서 품 어. 상쾌한 새 튜브를 이동 합니다. 구슬이 들어 있는 튜브를 삭제 합니다. 구슬 DNA 바인딩한 > 700 혈압이 너무 커서 시퀀싱 할 수 있는. 상쾌한, 추가 0.2 x 볼륨 (40 µ L, 샘플에서 0.75 x Ampure 버퍼의 총 결과) Ampure XP 비드 펜션과 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합의. 5 분, 5 분 동안 마그네틱 스탠드에 별도 구슬에 대 한 실 온에서 품 어. DNA를 포함 하는 상쾌한 삭제 < 200 bp, 무료 뇌관, 뇌관 이합체, 및 너무 작은 조각 시퀀싱 할 게. 마그네틱 스탠드에 튜브를 둡니다. 구슬 세척, 700 µ L 80% 에탄올의 추가, 비드 펠 렛을 방해 하지 않도록 돌보는 및 30에 대 한 품 어 s. 상쾌한 삭제, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 타고 그리고 비즈 10 mM Tris Cl pH 8.0의 100 µ L에서 resuspend. 10 번, 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 1 분 동안 실 온에서 품 어. Ampure XP 비드 현 탁 액의 0.8 x 볼륨 (80 µ L)를 추가 합니다. 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 하한값 크기 선택이 2 차 최종 라이브러리 뇌관 뇌관 이합체의 완전 무료입니다 보장 합니다. 5 분 동안 마그네틱 스탠드에 구슬 하 고 상쾌한을 삭제 합니다. 비드 펠 렛 30 80% 에탄올의 700 µ L로 두 번 씻어 s 각각 위와 같이 마그네틱 스탠드에 튜브를 떠나 있는 동안. 마그네틱 스탠드에 여전히 튜브, 에탄올의 모든 흔적을 제거 합니다. P10 피 펫을 사용 하 여 튜브 에탄올의 방울을 밀어 수 있습니다. 최대 5 분에 대 한 증발 잔여 에탄올을 하자. 마그네틱 스탠드 오프 튜브 고 비즈 10 mM Tris Cl pH 8.0의 50 µ L에서 resuspend. 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합. 5 분, 다음 마그네틱 스탠드에 별도 구슬에 대 한 실 온에서 품 어. 신선한 튜브 상쾌한 전송. 이것은 마지막이 C 라이브러리, 계량 하 여 제조업체의 지침에 따라 다음 세대 시퀀싱 컴퓨터에서 시퀀싱 준비 이다.