JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Entwicklungsbiologie

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Published: December 18, 2017
doi:
10.3791/56960
, , , ,
1Department of Internal Medicine, Division of Gastroenterology,University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, Division of Infectious Disease,University of Michigan

Summary

Этот протокол описывает измерение проницаемость эпителия барьер в реальном времени следующие фармакологического лечения человека кишечные organoids с помощью флуоресцентной микроскопии и жить микроскопии клетки.

Abstract

Достижения в 3D культуры кишечных тканей, полученные через биопсии или генерируется из плюрипотентных стволовых клеток через направленного дифференцирования, привели к модели сложных в vitro слизистой оболочки кишечника. Используя эти новые модели систем потребует адаптации инструментов и методов, разработанных для систем 2D культуры и животных. Здесь мы опишем технику для измерения проницаемость эпителия барьер в человека кишечные organoids в реальном времени. Это достигается путем микроинъекции дневно меченых декстрана и изображений на инвертированным микроскопом с epifluorescent фильтрами. Реальном времени измерения проницаемости барьер в кишечных organoids облегчает поколения с высоким разрешением временных данных в тканях человека кишечного эпителия, хотя этот метод может быть применен также для фиксированной timepoint изображений подходы. Этот протокол является легко могут быть приспособлены для измерения проницаемость эпителия барьер после воздействия фармакологических агентов, бактериальных продуктов или токсинов или живые микроорганизмы. С незначительными изменениями этот протокол также может служить в качестве общего грунт на микроинъекции кишечных organoids и пользователи могут выбрать дополнить этот протокол с дополнительных или альтернативных нисходящие приложения после микроинъекции.

Introduction

Кишечного эпителия образует избирательный барьер, опосредует направленного транспорта питательных веществ, H2O, ионов, и отходов при сведении к минимуму неспецифических диффузии опосредованной обмен других частиц между просвета и Мезенхимальные ткани или крови поставки1,2. Неспецифические проницаемость кишечного эпителия барьер уже давно считается ключевых функциональных параметров в здоровье и болезни3,4,5,6, которая отражает скорость Диффузия малых молекул через эпителий через параклеточный пространства. Измерения проницаемости эпителиальных барьер может проводиться в животных модели7 и8 человека пациентов через проглатывание лактулоза, который имеет без конкретных транспортер в желудочно-кишечном тракте и последующего сбора и измерение концентраций лактулоза в периферической крови. Альтернативные попадает маркеры барьерной функции такие как дневно обозначенные углеводы являются также доступны9,10. Этот подход был адаптирован для эпителиальных клеток кишечника культур, выращенных на Transwell поддерживает11, упрощенный подход, который позволяет для большего контроля экспериментальный, но также подверглась критике как бедных предсказатель в vivo проницаемость отсутствием дифференцированных эпителиальных подтипы и ткани структура12. С помощью камеры представляют собой еще один подход и позволяют для измерения эпителиальных барьерной функции в целом интестинальную ex vivo13. Применение этого метода часто ограничивается ткани наличия и состояния13,14. Таким образом, необходимы новые методы, которые баланс воспроизводимость и пропускную способность с физиологическое значение.

Недавние события в в vitro органогенеза привели к принятию систем модели 3D культуры ткани как сложные платформы для изложив динамика сложных тканей15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. В частности, человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC) производные человека кишечные organoids (HIOs)19,24 появились как воспроизводимость и экспериментально шансов справиться с возникающими модель системы для изучения хост микробных взаимодействий и Эпителиальный барьер динамика25,26,27,28. Аналогичным образом человеческие ткани производные organoids (также известный как enteroids) могут быть получены от простой биопсия процедура и может использоваться как шансов справиться с возникающими системы для изучения физиологии человека и болезнь15,29,30. Микроинъекции человека кишечные organoids позволяет для доставки экспериментальных соединений25 или жить микробы25,31,32,33 к апикальной эпителия поверхность органоид люмен. Лесли и Хуан и др. 25 недавно адаптировать эту технику для измерения проницаемости барьер в HIOs, microinjected с флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) помечены декстрана, после воздействия бактериальных токсинов.

Этот протокол предназначен в качестве руководства для измерения проницаемость эпителия барьер в hPSC производные HIOs и HIOs тканей, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии. С незначительными изменениями он также может служить общей грунт на микроинъекции HIOs с экспериментальной соединений. Пользователи могут дополнить этот протокол с дополнительных или альтернативных нисходящие приложения после микроинъекции.

Protocol

Нормальный, обезличенных кишечных тканей человека взрослых был получен от умерших доноров через Дар жизни, штат Мичиган. Человека ES клеток линии H9 (низ реестра #0062) была получена из WiCell научно-исследовательский институт. Все человеческие ткани, используемые в этой работе была получена из неживых доноров, де была определена и проводилось с согласия IRB Мичиганского университета (протокол # HUM00093465 и HUM00105750). 1. microinjector установки Получите материалы, перечисленные в Таблице материалов. Место микроманипулятор, рассечения объем и источник света в биобезопасности кабинета. Очистите микроинъекции установки с 70% этанол или других дезинфицирующих до экспериментального использования. Избегайте длительного воздействия дезинфицирующих средств, содержащие отбеливатель, который может разъедать оборудование микроинъекции.Примечание: На рисунке 1приведен пример полного microinjector Ассамблеи. Положение области рассечения так что глаз кусок может использоваться через порт доступа в щит для кабинета биобезопасности. Попеременно используйте чистый скамейке с позитивные воздуха потока системы вместо биобезопасности, кабинет с точками доступа Микроскоп. Соберите микроманипулятор на правой стороне микроскопа согласно инструкциям производителя и таким образом, чтобы элементы управления можно легко добраться и скорректированы. Микроманипулятор следует быть смонтированы на железной плите или иначе стабилизировалась.Примечание: Левша пользователям может потребоваться место микроманипулятор слева от области рассечения. Смонтировать держатель микропипеткой микроманипулятор руку и подключить аналоговый труб, вставив его в держатель микропипеткой. Заполните шприц 10 мл стекла с приблизительно 5-7 мл стерильного минерального масла. Подключение 10 мл шприц стекла, заполнены с минеральным маслом для открытого конца аналоговый труб с помощью механизма блокировки Luer. Место стеклянный шприц слева от области рассечения, напротив от микроманипулятор. Осторожно отожмите шприц, толкая нефтепродуктов через трубку. Флеш примерно 10 капель минерального масла от кончика микропипеткой держателя и собирать в чашке Петри или аналогичных судна и отбросить.Примечание: Этот шаг удаляет все воздуха из шланга и должны быть выполнены перед каждой сессии микроинъекции. 2. Подготовка микроинъекции за 24 часа до микроинъекции: Готовят раствор декстрана FITC приостановив повторно FITC декстрана в концентрации 2 мг/мл в стерильного физиологического раствора или PBS. Подготовить общий объем > 250 мкл.Примечание: Выше или ниже концентрации FITC-декстран может использоваться, начиная от приблизительно 0,1 – 10 мг/мл. Отрегулируйте концентрацию FITC-декстрана в соответствии по течению визуализации приложений. Установка органоид культур на 4 – или 8-Ну стекло камеры слайды или другие культуры судно подходит для жить микроскопии, до 4-6 HIOs за Ну, встроенных в 50 мкл ячейки матрицы решения и культивировали в EGF, льют и R-Spondin (ENR) фактор роста СМИ 19 ,24. Позаботьтесь, чтобы пространство organoids равномерно (примерно 5 мм друг от друга) во избежание захвата нескольких HIOs в одном микроскопическом поле во время анализ изображений в реальном времени. Полное руководство по HIO культуры и поддержания см МакКрекен et al. 24.Примечание: Этот протокол был разработан с использованием стволовых клеток, полученных HIOs и представитель результаты (см. ниже) демонстрируют использование этой модели культуры ткани. Однако тот же протокол легко адаптируется к ткани производные кишечного эпителия organoids15,29. Ткани производные HIOs, обычно меньше, чем PSC-производные HIOs и отсутствие поддержки мезенхимальных базолатеральной клеток структура15,29,30. Микроинъекции ткани производные HIOs может потребовать большей степени технические возможности и опыт. Степени, к которому эпителиальных барьер проницаемости данных, полученных с помощью ткани производные HIOs может коррелировать с hPSC производные HIOs неизвестно. Инкубируйте HIOs в инкубатор культуры стандартной ячейки на 42 ° C и 5% CO2 до микроинъекции. 30 минут до микроинъекции, включите биобезопасности кабинета и поднять щит стекла на оптимальную рабочую высоту. Удалите все ненужные элементы из кабинета биобезопасности. Беспорядок увеличивает риск разливов или других несчастных случаев при работе в замкнутых пространств. Спрей и тщательно очистите рабочую поверхность с 70% этанол или других дезинфицирующих средств. Протрите чистой, с использованием бумажным полотенцем. Проверьте уровень минерального масла в шприц стекла придает microinjector. Если есть меньше чем 3 мл оставшихся минерального масла, отвинтить шприц и пополнить внутри шкафа, стараясь избегать введения пузыри биобезопасности. Заполнять не более чем 7 мл. Включите лампу для освещения рассечения сферы. Отрегулируйте окуляр для личного комфорта. Позиция микроманипулятор справа от области рассечения. Закрепите микроманипулятор для железной пластине с помощью магнитного стенд. Магнитного стенд переключатель в положение OFF, чтобы отрегулировать положение микроманипулятор и закрепите подставку для утюга, установив магнитного стенд в положение ON. Микрокапиллярной установка Получить один 1 мм стекловолокном из контейнера хранения, предоставляемых производителем. Вставьте стекловолокном через центр медной Отопление катушки микропипеткой съемник.Примечание: Для руководства по подготовке микропипеткой съемник рис. Положение нити накала, таким образом, чтобы медь Отопление катушки примерно в середине стекловолокном. Это будет гарантировать, что провокатор генерирует два полезная микроинъекции иглы от каждого стекловолокном. Безопасные стекла накаливания с помощью струбцины, затянув верхней зажим во-первых, убедившись, что стекловолокном обеспечивается в рамках зубчатый рощу, чтобы предотвратить поломки. Расширение съемник руку в ее максимально вертикальном положении перед затягиванием зажим снизу.Примечание: Этот шаг имеет важное значение. Неспособность полностью расширить руку съемник приведет к нерегулярные разделения этих двух секций стекловолокном. Проверьте настройки на отопление и потянув механизм.Выберите тепла #1 с переключателем (990) и задайте ТЯНУТЬ на 059 (рис. 2). Включите инструмент, с помощью переключателя вкл/выкл. Закройте щита защитные Плексиглас и нажмите кнопку ТЯНУТЬ на нижней правой лицо провокатор. Катушка медная начнет нагреваться и будет светиться ярко-оранжевый. Как температура поднимается, стекловолокном начнет растягиваться и в конечном итоге разделить. После разделения двух концах стекловолокном будет выключить прибор.Примечание: Медные катушки останется очень горячий в течение нескольких минут. Вытащил стекловолокном будет называться «микрокапиллярной» с этого момента в протоколе. Будьте осторожны, не прикасайтесь к медной катушки, удалить один из microcapillaries стекла. Микрокапиллярной должны иметь точки очень хорошо. Ручка микрокапиллярной тщательно с латексом или нитриловые перчатки и немедленно приступить к биобезопасности кабинета, содержащие microinjector установки.Примечание: Микрокапиллярной стекло очень острые и очень хрупкие. Обращаться с осторожностью. Отвинтите колпачок микроманипулятор руку. Вставить в открытый конец держателя микропипеткой тупой конец вытащил микрокапиллярной и нажимаем ее внутрь до его остановки. Закрепите тупой конец микрокапиллярной на руке микроманипулятор, снова затянув крышки.Примечание: При установке микрокапиллярной на системе микроинъекции заботиться, чтобы не прикасайтесь заостренный конец. Это уменьшит вероятность загрязнения и сохранить точку штрафа для микроинъекции. Неспособность правильно защитить микрокапиллярной может привести к нестабильности или обрыва нити стекла во время микроинъекции. Откройте кончик стекла микрокапиллярной. Во время подготовки вытащил стекла микрокапиллярной кончик точки скорее всего будет таять в таким образом, чтобы запечатать острый конец микрокапиллярной. Чтобы удалить эту блокировку: Расположите микроманипулятор, таким образом, что микрокапиллярной указывает вниз на стадии стекла рассечения сферы не касаясь этой поверхности. Найти стерильную пластиковую поверхность (в нижней части крышки плиты культуры работает отлично) и поместите его на микроскопа непосредственно под микрокапиллярной иглы на сцене рассечения сферы. Центр кончик микрокапиллярной под области просмотра и убедитесь, что она видна при взгляде через окуляр микроскопа до 1.5 X увеличение. С помощью элементов управления микроманипулятор, медленно заранее микроманипулятор руку и микрокапиллярной к крышке стерильных пластиковых культуры, до тех пор, пока кончик едва контакты пластиковой поверхности и кончик микрокапиллярной вырывается.Примечание: Цель для маленьких возможного перерыва, который позволяет для потока жидкости из стекла накаливания для того, чтобы свести к минимуму ущерб, причиняемый HIO во время микроинъекции. Назад микрокапиллярной от поверхности стерильных свести к минимуму вероятность случайного обрыва перед продолжением. Проверьте микрокапиллярной для потока путем отжимать стеклянный шприц, толкая нефтепродуктов через трубку. Если был открыт в конце микрокапиллярной вы увидите небольшой капли нефтепродуктов возникают от кончика микрокапиллярной через несколько секунд. Если этого не произойдет, повторите предыдущий шаг и повторного тестирования. 3. стерильный микроинъекции Примечание: После того, как микрокапиллярной подготовлен, установлены и испытаны, начните microinjecting HIOs. Рисунок 3 показывает ткани производные HIO который были успешно введены с FITC-декстрана. Заполните микрокапиллярной с инъекционного материала. Погрузите кончик стекла микрокапиллярной в FITC декстрана инъекции подвеска, стараясь избежать нарушения кончик микрокапиллярной против стороны или нижней части трубки. После того, как кончик микрокапиллярной погружен в раствор, тяните обратно на минеральное масло шприцем привлечь около 10 мкл суспензии декстрана FITC в микрокапиллярной.Примечание: Рекомендуется использовать 1,5 мл или 0,5 мл трубки для инъекций решения/культур, так как они будут наиболее легко доступны для установленных микрокапиллярной. Кроме того инъекции, что решения могут быть извлечены из стерильных Петри или стерильной парафина, который может уменьшить вероятность травмы колюще-режущие предметы, ограничивая необходимость держать трубку в непосредственной близости к микрокапиллярной. Если приостановление высоковязких или открытие микрокапиллярной исключительно мала, это может занять несколько второй для заполнения микрокапиллярной. Не рисовать микроинъекции суспензий в микроинъекции пластиковых труб, как это может загрязнить весь микроинъекции системы. Остановите заполнение микрокапиллярной когда подвеска микроинъекции заполняет 90% от длины микрокапиллярной стекла. Слегка отожмите шприца до снятия микрокапиллярной от микроинъекции решение, чтобы убедиться, что кончик микрокапиллярной не содержит карманы воздуха.Примечание: Если изучение микрокапиллярной показывает карманы воздуха, пустые и повторного заполнения. Удалите знаке культуры HIO из инкубатора культуры клеток и передачи биобезопасности кабинет с microinjector. Снимите крышку с плиты HIO культуры в рамках кабинета биобезопасности и центр первой скважины на сцене Микроскоп, так что это ясно видны через окуляр сферы на самом низком настройки масштаба. Поверните руку микроманипулятор, таким образом, что микрокапиллярной указывает вниз в культуру HIO хорошо под углом > 45° по отношению к микроскопа. Легче всего это достигается поворотом вручную микроманипулятор кронштейна на горизонтальной оси в точке, где поддержка arm горизонтальных микроманипулятор соответствует вертикальной стойке, так как штраф контроль (Черные циферблаты) имеют ограниченный спектр движение. Расположите наконечник микрокапиллярной выше первой культуры в примерно в 1 см над поверхностью СМИ (рис. 3A). Представитель изображение, демонстрируя микроинъекции ткани производные кишечного эпителия organoids показан на рисунке 3B. Проверьте, что кончик стекла накаливания и HIO(s) видны через окуляр. Повторно наложите при необходимости. Заранее микрокапиллярной медленно поворачивая ручку управления z-оси по часовой стрелке.Примечание: Судя положение кончика микрокапиллярной, особенно глубины, требует практики. Как отзыв нарушает поверхности средств массовой информации, обратите внимание на небольшие визуальные искажения кончик микрокапиллярной.Перейти с осторожностью, с этого момента, чтобы избежать нарушения микрокапиллярной против нижней части плиты культуры или повреждения HIOs. Проколоть HIO с микрокапиллярной кончиком. Внешняя поверхность HIO будет угнетать слегка микрокапиллярной начинает применять давление и будет поп обратно в форму, как кончик проникает люмен. Это может быть трудно определить кончик микрокапиллярной в пределах HIO люмен. Настройки освещения или увеличение охвата рассечения если есть сложности, видя микрокапиллярной. Удалите руки от контроля микроманипулятор когда микрокапиллярной правильно с кончика микрокапиллярной вблизи центра HIO. Отожмите минеральное масло шприцем слегка добиваться решения микроинъекции из микрокапиллярной и в просвете HIO. HIO может слегка расширяться, чтобы вместить объем инъекции.Примечание: позаботьтесь, чтобы избежать чрезмерного заполнения HIO как это вызовет органоид лопнуть. Как правило любой видимый расширение объема HIO означает, что пришло время прекратить. Средний объем Зрелые HIO просвета находится примерно в 1 мкл, но могут значительно отличаться. Автоматизированная шприц, насосы могут быть использованы вместо ручной шприц для точного управления вводится тома. Снять микрокапиллярной от HIO, используя элемент оси z и позиции над поверхностью средств массовой информации. Перемещение к следующей цели HIO с микрокапиллярной, расположенную над СМИ, чтобы избежать случайного повреждения HIOs во время маневрирования и придать подобным образом (см. шаги 3.6-3.11). Пополнение микрокапиллярной, используя описанный выше подход.Примечание: Если кончик влезает в любой момент во время микроинъекции, не пытайтесь продолжать инъекции. Измените кончик согласно приведенным ниже инструкциям. Измените микрокапиллярной между процедурами или в случае поломки. Ослабьте зажим на конце микроманипулятор руку и удалить микрокапиллярной из держателя микропипеткой.Предостережение: Не прикасайтесь микрокапиллярной вблизи острым концом. Тонкой точке микрокапиллярной чрезвычайно острые и будет легко прокола перчатки и кожи. Осторожность и быть в курсе всех движений, обработка микрокапиллярной, с помощью манипулятора, только и никогда не поставив руки между точкой микрокапиллярной и HIO культур. Обратиться за медицинской помощью сразу в случае иглой от микрокапиллярной, содержащие инфекционных агентов или токсинов.Примечание: В некоторых случаях, это может быть трудно визуально подтвердить успешное HIO микроинъекции. Видимость ясно микроинъекции суспензий повышается путем использования помимо повышенных концентраций FITC-декстрана. 4. медикаментозное лечение HIOs Для проверки соединений, доставлены в апикальной эпителия, Ресуспензируйте в стерильных PBS, содержащий 2 мг/мл FITC-декстран и microinject в HIO люмен, как указывалось выше (раздел 3). Для представителя эксперимента Ресуспензируйте Clostridium difficile токсин TcdA в 12,8 нг/мкл в PBS, содержащих FITC-декстрана. Для проверки соединений, доставлены в отделение базолатеральной, заменить внешний носитель культуры нового носителя, содержащего 2 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic кислота (EGTA)(positive control), только транспортного средства PBS (отрицательный контроль ), или другие экспериментальные соединение после микроинъекции FITC-декстрана.Примечание: Дозировки и сроки применения фармакологических соединений, токсинов или другие агенты могут варьироваться в зависимости от экспериментальных вопрос. 5. Визуализация Microinjected Organoids жить Начните жить изображения сразу после микроинъекции. Передать флуоресцентный микроскоп оснащен увлажненные камере поддерживается при 37 ° C и 21% O2 и 5% CO2 с автоматизированной живой клетки системы культуры пластин. Закройте экологические камеры и начать процесс визуализации. Запуск программного обеспечения для анализа изображений (например, softWoRx) с рабочего стола. Нажмите «Файл» и выберите пункт «Получить (решимость 3D)» для инициализации изображений и программного обеспечения управления микроскопом. Установить FITC возбуждения/выбросов (475 Нм возбуждения/523 Нм выбросов), установите мощность передачи до 5% и объектив 4 X. Установите время экспозиции до 0,025 мс (рис. 4A).Примечание: Время экспозиции следует разнообразить под силу флуоресцентного сигнала. В общем FITC флуоресценции сигнал только будет уменьшаться. Таким образом для обеспечения максимальной чувствительности, раз первоначального воздействия должна быть скорректирована таким образом, что записанные флуоресцентного сигнала находится чуть ниже точки насыщения камеры и изображений программное обеспечение. Найти HIOs на 4 кратном увеличении с помощью цифровой контроллер, прилагается к Микроскоп. Центр HIO в течение просмотра поля (рис. 4A). Нажмите «Вид» на панели инструментов и выбрать «Точку списка» раскрыть новое окно. Нажмите кнопку «Пометить точку» для хранения текущей позиции этапа в списке точек (рис. 4A). Повторите шаги, 5.4 и 5.5 позиции всех HIOs были записаны. Используя Блокнот или цифровой записи, запишите уникальный идентификационный номер, присваиваемый каждой позиции запрограммированных микроскопии и изображения, снятые в этом положении. Файлы изображений будут помечены этот номер и будет важно, чтобы связать изображение идентификационные номера с конкретными HIOs и лечения после завершения сбора данных. Для настройки автоматизированных изображения коллекции, нажмите «Файл» и затем «Эксперимент» в панели инструментов. Имя эксперимент с даты или другое уникальное имя. Установите параметры для коллекции изображений, перейдя через каждую из вкладок параметр, как показано на рисунке 4В. Снимите флажок «Z секционирование» на вкладке «Вырезание». На вкладке «Каналы» введите параметры из окна Верхний левый «решить 3D». Чтобы сэкономить время, первая строка будет автоматически заполнять, когда флажок слева в. На вкладке ‘ покадровой», установите флажок «Время перерыва» и введите временной интервал между изображениями в строке с надписью «Покадровой» и общая продолжительность эксперимента в строке с надписью «Длительность». Программное обеспечение автоматически рассчитает количество точек времени. На вкладке «Точек» установите флажок «Список точек визит».Вы можете также вручную ввести конкретные точки номера, чтобы быть включены в эксперимент, введя в текстовом поле. Не изменяйте параметры по умолчанию на вкладках «Панелей» или «Действия». Нажмите на вкладку «Run» ввод даты эксперимента в поле с надписью «имя файла образа» и задайте данные сохранить место в разделе «Параметры». Нажмите на зеленую стрелку, чтобы запустить эксперимент макрос. Счетчик промежуток времени будет отслеживать ход экспериментальной. В конце курса запланированного времени экспортировать и сохранить все файлы изображений в виде 24-бит RGB TIFF изображений (рис. 4 c). На панели инструментов выберите процесс, следуют задачи строитель. В меню построителя задач добавьте файлы, перейдя к папке данных, указанных в 5,9. Выделите все файлы, оканчивающиеся на «.dv» «*.dv», введя в командной строке. Выберите все (Ctl + A) и нажмите кнопку «Добавить». Нажмите на + под раздел под названием «Задача.» Выберите «Экспорт as…» и перейдите на вкладку «Параметры». Набор «Экспортировать формат», чтобы «TIFF изображений» и установите флажок ниже, чтобы добавить «Custom выходную папку». Это место, куда будут экспортированы изображений TIFF. Выберите 24-битный RGB под «Тип вывода TIFF» и нажмите «Готово». Нажмите кнопку «Отправить в очередь» для запуска макроса экспорта. На другом компьютере, скопируйте изображения TIFF, экспортируются в 5.11 на сервер или внешний драйвер, если вы будете выполнять анализ пост изображений (раздел 6).Примечание: HIO ткани и средства массовой информации могут быть сохранены для гистологии34, ПЦР35), Западная пятно36, или других течению анализа. 6. после визуализации анализа Убедитесь, что ImageJ37 установлена и работает на компьютере, который будет использоваться для анализа.Примечание: Фиджи37 это альтернативное распределение ImageJ основной программы, которая будет работать одинаково хорошо для этого анализа. Запуск пакета анализа, выбрав «Процесс», то «Партии» и, наконец, «Макро» из меню ImageJ. Установите вход в каталог, содержащий изображения TIFF, собранных в ходе экспериментальной время. Откройте файл макроса ImageJ «thesholdmeasure.ijm» или непосредственно копировать/вставить код макроса в окне. Нажмите кнопку «Процесс», чтобы начать обработку файлов.Примечание: Минимальное пороговое значение x (setThreshold(x,255);) может быть присвоено любое число 0 – 255 и должны быть скорректированы, с тем чтобы ликвидировать фон флуоресценции. Значения < 100 рекомендуются. Эмпирически определить соответствующий пороговое значение, макрос изображений на одно изображение, представляющее органоид с не флуоресцентного сигнала. Средняя интенсивность этого изображения может служить в качестве руководства для установки порога надлежащим образом. Для представителя анализа, представленные ниже порог был установлен к «42». ImageJ будет производить большой таблицы, содержащей области всех пикселов в пределах порогового значения интенсивности, и среднее, медиана, минимум и максимум (лимит) интенсивность значение для района в пределах порогового значения интенсивности. Сохраните как CSV или XLS. Изменения в интенсивности с течением времени может быть вычислена в таблице39 , манипулируя таблицы данных для выполнения вычисления ниже или может быть автоматизированных с помощью подходящего языка программирования. Пример анализа сценария написан на R 40 предоставляется с этой рукописи.Примечание: Для каждого HIO относительной флуоресценции интенсивности может быть определена количественно как . Ликвидации время 41 (t1/2) FITC-декстрана в просвете HIO была рассчитана следующим образом: Во-первых, вычислить «площадь под кривой» (AUC)) от кривой, назвав относительной флуоресценции интенсивности с течением времени (t): Затем рассчитайте «Распродажа» () ставка с объемом распределения (Vd) определяется как 1 для нормализованных флуоресценции при t = 0: Далее, определить «ликвидация константа скорости» () как: И наконец, рассчитать время «ликвидации» (t1/2) как: Таким образом, является снижение уравнение:

Representative Results

HIOs отличаются от человеческих плюрипотентных стволовых клеток и культивировали в ячейке матрицы решения как ранее описанных19,24. После 4 недель в культуре HIOs была расширена достаточно для микроинъекции. HIOs были microinjected с 4 кДа конъюгированных FITC декстрана в PBS или PBS, содержащие Clostridium difficile токсин TcdA приостановлено. C. difficile является оппортунистических желудочно-кишечного тракта возбудителя, что экспонаты токсин опосредованной эпителиальных токсичности в HIOs25. Как положительный контроль EGTA был добавлен в СМИ HIO культуры в подмножество HIOs вводят с PBS и FITC-декстрана. EGTA является кальций хелатором, что вызывает быстрое де полимеризации Цитоскелет актина42. FITC флуоресценции контролируется в режиме реального времени на живой изображения микроскопа в пределах контролируемой окружающей камеры и изображений были захвачены в 10-минутными интервалами. Пост hoc анализ визуализации данных выявил существенные различия в сохранении FITC флуоресценции (рис. 5). HIOs вводят с PBS сохранил почти все флуоресцентного сигнала на t = 0, однако HIOs, которые также были введены с TcdA на лечение с EGTA выставлены существенное снижение интенсивности флуоресценции 8 часов после микроинъекции (Рисунок 5а). Визуализация данных были количественно для всех HIOs на все моменты времени для создания набора с высоким разрешением, представляющее относительные изменения в интенсивности флуоресценции со временем в каждом экспериментальном состоянии (Рисунок 5B). Различия в эпителиальной проницаемости были оценены путем расчета средней ликвидации время (t1/2 ) FITC для каждой группе лечения (Таблица 1) и сравнение различий между группами t t1/2 с помощью студента t-теста. Контроль лечение HIOs сохранил большинство FITC флуоресцентного сигнала для более чем 16 часов (t1/2 = 17 ± 0,3 ч). Лечение с EGTA значительно сократило время ликвидации FITC-декстран относительно управления HIOs (t1/2 = 2.6 ± 0,2 h; P = 1.3 x 10-8). В соответствии с ранее опубликованные результаты25, микроинъекции TcdA значительно увеличили проницаемость эпителия барьер относительно контроля лечения (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5.4 x 10-4). Таким образом внешние (EGTA) и microinjected (TcdA) соединения способны индуцировать значительные изменения в проницаемость эпителия барьер в HIOs. Эти результаты показывают, что воздействие широкий спектр фармакологических агентов, метаболитов, бактериальных продуктов, цитокины, факторы роста и других соединений на эпителиальные барьерной функции может оцениваться с использованием этого подхода. Лечение Период полураспада (h) SEM (h) Ниже 95% CI (h) Верхняя 95% CI (h) n Управления 17.11 0,3 16.45 17.78 11 EGTA 2.58 0.19 1,78 3.38 3 TcdA 7.56 0,63 5.93 9.18 6 Таблица 1: среднее время ликвидации (t1/2) для FITC-декстрана в HIOs лечение с EGTA или TcdA. Часов после микроинъекции единицы. Рисунок 1: базовый макет microinjector и микроманипулятор для HIO микроинъекции. Это изображение показывает полный состав оборудования, используемого для выполнения микроинъекции HIOs. Ключевые компоненты помечены и упорядочение информации можно найти в таблице материалы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: съемник микропипеткой. Медь, Отопление катушки hc, верхнего прижима c1, нижний зажим (c2), съемник руку (ПА), тепло выбор переключения (ht) обозначаются стрелками. Правильную настройку для тепла 1 и ТЯНУТЬ указаны в красный текст. Врезные показывает правильно установлены стекловолокном готова для отопления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: представитель изображения тканей, полученных HIO вводят с FITC-декстрана. (A) изображения, демонстрируя позиционирования стекла микрокапиллярной просто до вставки в HIO и микроинъекции. (B) Brightfield изображения тканей производные человека кишечные organoids после микроинъекции FITC-декстрана. Обратите внимание, что сигнал флуоресценции очевидно даже без использования специального фильтра набора. Эта окраска СПИДа микроинъекции точности. 3 кратном пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: Live визуализации процесса. (A) скриншот иллюстрирует шаги, необходимые для параметров Микроскоп, найти HIOs на слайде и сохранить позицию сцену для каждого HIO к записи образа. (B) предварительной визуализации параметров для захвата FITC канала на регулярной основе в каждой из позиций указаны в а. (C) после визуализации экспорта DV формат данных файлы TIFF изображений с одно изображение TIFF на HIO на момент времени.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: представитель результаты. (A) стволовых клеток получены человека кишечные organoids (HIO) microinjected с 2 мг/мл FITC-декстрана (4 кДа) образы на 20 часов. HIOs также были microinjected с PBS (управления) или Clostridium difficile токсин TcdA (12,8 нг/мкл) или лечение с 2 мм, EGTA добавлены внешних носителей культуры. 4 крат. (B) сюжет интенсивности среднее нормализованных FITC со временем в HIOs лечение с PBS (управления), TcdA или EGTA. Планки погрешностей представляют S.E.M. и n = 11 HIOs (контроль), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот Протокол устанавливает общего назначения метод для измерения проницаемость эпителия барьер и микроинъекции hPSC производные HIOs и ткани производные кишечных organoids в режиме реального времени. Мы также продемонстрировали наш подход к анализу и интерпретации данных, получаемых с помощью этих методов. Учитывая растущее принятие кишечных organoids модель систем16,20,,2128 и давний интерес к проницаемость кишечного барьера как физиологически соответствующих функциональных Результат3,4,5,6, мы ожидаем, что другие работающие в этой области будет иметь возможность применять и развивать эти методы.

Есть несколько шагов, которые имеют решающее значение для применения этого метода. Доступ к высоким качеством hPSC – или производных HIO ткани должны создаваться до широких экспериментов с микроинъекции ткани. HIO макроструктура может быть гетерогенных, изменения в размер и форму, хотя личность ткани и клеточной морфологии высоко воспроизводимый при использовании установленной методологии для создания HIOs24. Сферические HIOs, состоящий из одного полупрозрачные люмен и измерения диаметром около 1 мм идеально подходят для микроинъекции и измерения Люминал флуоресценции в режиме реального времени. В некоторых случаях будет не микроинъекции, в результате распада HIO или очевидные утечки введенного материала. Не удалось HIOs могут быть удалены из культуры также по усмотрению пользователя с помощью стандартной микропипеткой. Рассмотрим доступны на платформе тепловизионных объективов при выборе HIOs микроинъекции и изображений. В общем, 2-4 X объективов идеальны для захвата полного HIO флуоресцентные сигнал, хотя 10 X цели может быть использован, если линзы малой мощности не доступны или если имеющиеся HIOs < 1 мм в диаметре. Изображений программное обеспечение необходимо разрешить для автоматического захвата флуоресцентных изображений в определенных точках с течением времени.

Для того, чтобы потребностям экспериментальные возможны несколько модификации настоящего Протокола. Например результаты испытаний барьер функция может быть зависимым от молекулярного размера соединений в использование43 , и это может быть уместно для тестирования препаратов декстран разной молекулярной массы. Кроме того помимо флуоресценции изображений в качестве показателя общей структурной целостности тканей25может выполняться brightfield изображений. При выполнении микроинъекции живых бактерий25,28,,3132,,3344, это может быть необходимо добавить пенициллин и Стрептомицина или гентамицин HIO культуры средств массовой информации до или после микроинъекции. Вне микрокапиллярной будет быть загрязнены во время наполнения с подвеской бактериальной культуры, и это может быть передана СМИ HIO. Поочередно микроинъекции может выполняться на HIOs приостановлено в внеклеточного матрикса (например, Matrigel) без СМИ, добавляя средства массовой информации, после завершения микроинъекции. Это может ограничить загрязнение внеклеточного матрикса и внешний облик HIO. При планировании микробного роста анализов, это может быть необходимо удалить антибиотиков в СМИ после 1-2 h, чтобы избежать замедления или предотвращения роста microinjected организмов.

Наконец признавая, что не все исследователи будут иметь доступ к оборудованию микроскопии, подходит для изображений в vitro , важно отметить, что процедуры, изложенные в настоящем Протоколе, для сбора данных флуоресценции могут применяться для получения изображений в фиксированной timepoints с помощью стандартных epifluorescent микроскопии без автоматизированного образов или экологического контроля. Примеры этого подхода можно найти в докладах, Лесли и Хуан и др. 25, обследовавший C. difficile токсин деятельности в hPSC производные кишечных organoids и Karve и Pradan et al. 44, обследовавший проницаемость эпителия барьер в подобных hPSC производные кишечных organoids microinjected с живой E. coli. Руководство по эксплуатации рентгенографическое оборудование может привести к большей вариации и трудности в деле нормализации флуоресцентного сигнала. При выполнении ручной изображений FITC-декстрана вводят HIOs важно поддерживать фиксированный масштаб, флуоресцентный возбуждения интенсивности и длительности выдержки на протяжении эксперимента, чтобы избежать искажения измерений интенсивности флуоресценции.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Drs. Stephanie Спон и Базель Abuaita для многих полезных обсуждений по органоид микроинъекции. JRS поддерживается консорциумом кишечных стволовых клеток (U01DK103141), совместный исследовательский проект, финансируемый национального института диабета и пищеварительной и заболеваний почек (NIDDK) и национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID). JRS и VBY поддерживаются NIAID роман, альтернативные модели систем для кишечных заболеваний (NAMSED) консорциума (U19AI116482). DRH поддерживается механизмов микробного патогенез обучения грант от национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID, T32AI007528) и клинические и поступательного науки награду Мичиган института клинической и здравоохранения Исследований (UL1TR000433).

Полные данные файлы и код анализа данных, используемые в этой рукописи доступны на https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.

Materials

EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) Bioworld 405200081
Cell matrix solution (Matrigel) Corning 354230
Deltavision RT live cell imaging system GE Life Sciences 29065728 http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
Camera GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
softWoRx Imaging software GE Life Sciences 29065728 Included with Deltavision system
Biosafety cabinet Labconco Cell Logic+ http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
1X PBS Life Technologies 10010-023
Advanced DMEM-F12 Life Technologies 12634-010 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
B27 supplement (50X) Life Technologies 17504044 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
L-glutamine (100X) Life Technologies 25030-081 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
HEPES buffer Life Technologies 15630080 Component of ENR media; see McCraken et al. 24
Manipulator Narshge UM-3C
Micromanipulator Narshge UM-1PF
Pipette Holder Narshge UP-1 Alternate to Xenoworks pipette holder
Magnetic stand Narshge GJ-1
Dissecting scope Olympus SX61 Recommended scope, although other models are likely compatible
Olympus IX71 Fluorescent microscope Olympus IX71 Included with Deltavision system
CoolSNAP HQ2 Photometrics 29065728 Included with Deltavision system
Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein R&D Systems 8619-GT-020
EGF R&D Systems 236-EG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
R-spondin 1 R&D Systems 4645-RS Component of ENR media; see McCraken et al. 24
Noggin R&D Systems 6057-NG Component of ENR media; see McCraken et al. 24
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410
FITC-dextran (4 kDa) Sigma-Aldrich 46944
Micropipette puller Sutter Instruments P-30
Nunc Lab-Tek II Chamber Slides ThermoFisher Scientific 154526PK
Glass filaments WPI TW100F-4
Micropipette holder Xenoworks BR-MH2 Preferred device
Analog Tubing kit Xenoworks BR-AT
1/16 in clear ferrule Xenoworks V001104
1-1.2 mm O-ring Xenoworks V300450
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Standring, S., Borley, N. . Gray’s anatomy: The anatomical basis of clinical practice. , (2008).
  2. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2017).
  3. Clayburgh, D. R., Shen, L., Turner, J. R. A porous defense: The leaky epithelial barrier in intestinal disease. Lab Invest. 84, 282-291 (2004).
  4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
  5. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability-a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterol. 14, 189 (2014).
  6. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: A therapeutic target?. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14, 9-21 (2017).
  7. Krugliak, P., Hollander, D., Schlaepfer, C. C., Nguyen, H., Ma, T. Y. Mechanisms and sites of mannitol permeability of small and large intestine in the rat. Dig Dis Sci. 39, 796-801 (1994).
  8. Johnston, S. D., Smye, M., Watson, R. P. Intestinal permeability tests in coeliac disease. Clin Lab. 47, 143-150 (2001).
  9. Salles Teixeira, T. F., et al. Intestinal permeability measurements: General aspects and possible pitfalls. Nutr Hosp. 29, 269-281 (2014).
  10. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J Immunol Methods. 421, 44-53 (2015).
  11. Donato, R. P., et al. Studying permeability in a commonly used epithelial cell line: T84 intestinal epithelial cells. Methods Mol Biol. 763, 115-137 (2011).
  12. Balimane, P. V., Chong, S. Cell culture-based models for intestinal permeability: A critique. Drug Discov Today. 10, 335-343 (2005).
  13. Vidyasagar, S., MacGregor, G. Ussing chamber technique to measure intestinal epithelial permeability. Methods Mol Biol. 1422, 49-61 (2016).
  14. Herrmann, J. R., Turner, J. R. Beyond Ussing’s chambers: contemporary thoughts on integration of transepithelial transport. Am J Physiol Cell Physiol. 310, C423-C431 (2016).
  15. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  16. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
  17. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11, 347-358 (2016).
  18. Rookmaaker, M. B., Schutgens, F., Verhaar, M. C., Clevers, H. Development and application of human adult stem or progenitor cell organoids. Nat Rev Nephrol. 11, 546-554 (2015).
  19. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
  20. Aurora, M., Spence, J. R. HPSC-derived lung and intestinal organoids as models of human fetal tissue. Dev Biol. 420, 230-238 (2016).
  21. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150, 1098-1112 (2016).
  22. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, (2015).
  23. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Curr Pathobiol Rep. 4, 47-57 (2016).
  24. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6, 1920-1928 (2011).
  25. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  26. Leslie, J. L., Young, V. B. A whole new ball game: Stem cell-derived epithelia in the study of host-microbe interactions. Anaerobe. 37, 25-28 (2016).
  27. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/Colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291, 3759-3766 (2016).
  28. Hill, D. R., Spence, J. R. Gastrointestinal organoids: Understanding the molecular basis of the host-microbe interface. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 3, 138-149 (2017).
  29. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8, 2471-2482 (2013).
  30. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  31. Engevik, M. A., et al. Loss of nHE3 alters gut microbiota composition and influences bacteroides thetaiotaomicron growth. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G697-G711 (2013).
  32. Forbester, J. L., et al. Interaction of salmonella enterica serovar typhimurium with intestinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells. Infect Immun. 83, 2926-2934 (2015).
  33. Engevik, M. A., et al. Human clostridium difficile infection: Inhibition of nHE3 and microbiota profile. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308, G497-G509 (2015).
  34. Bancroft, J., Gamble, M. . Theory and practice of histological techniques. , (2008).
  35. Kennedy, S., Oswald, N. . PCR troubleshooting and optimization: The essential guide. , (2011).
  36. Kurien, B., Scofield, R. . Western blotting: Methods and protocols. , (2015).
  37. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  38. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  39. Winston, W. . Microsoft excel data analysis and business modeling. , (2016).
  40. R Core Team. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2017).
  41. Rosenbaum, S. . Basic pharmacokinetics and pharmacodynamics: An integrated textbook and computer simulations. , (2016).
  42. Selden, L. A., Estes, J. E., Gershman, L. C. The tightly bound divalent cation regulates actin polymerization. Biochem Biophys Res Commun. 116, 478-485 (1983).
  43. Vojdani, A. For the assessment of intestinal permeability, size matters. Altern Ther Health Med. 19, 12-24 (2013).
  44. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and shiga toxin producing escherichia coli. PLoS One. 12, e0178966 (2017).

Tags

Epithelial Barrier PermeabilityHuman Intestinal OrganoidsReal-time MeasurementFITC-dextranMicroinjectionGastroenterologyToxinsBacterial ProductsPharmacologic TreatmentsVisualizationQuantitative Measure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y., Spence, J. R., Young, V. B. Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (130), e56960, doi:10.3791/56960 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image