블 리스, lignification 역학 공부에 대 한 이중 라벨 프로토콜 개발 되었다. 합성 monolignol를 사용 하 여 기자와 SPAAC 및 CuAAC bioorthogonal의 순차적 결합 반응,이 방법론 포장 lignins에서 planta에의 속 규제 요인의 심층 분석 하는 방법 클릭 합니다.
리그 닌은 지구상에서 가장 널리 퍼진 biopolymers 중 lignocellulosic 바이오 매스의 주요 구성 요소. 이 페 놀 폴리머 개발 및 더 높은 식물의 생활에 중요 한 구조 및 보호 역할을 하고있다. Lignification 프로세스에서 vivo에서 강력 하 게 규제 하는 복잡 한 메커니즘에 영향을 많은 식물 유래 제품의 산업 어, 비록 과학계는 여전히 그들을 해독 하기 위해 갈 길이 있다. 간단한 3 단계 워크플로에서 여기에 소개 하는 듀얼 라벨 프로토콜 bioimaging 연구를의 적극적으로 식물 조직의 영역을 lignifying 수 있습니다. 첫 번째 단계는 2 명의 독립적인 화학 기자, lignin H와 G 단위를 두 개의 네이티브 monolignols의 대리 모 알선 대사 관에 구성 되어 있습니다. 리그 닌 고분자 성장으로 설립, 후 각 기자 특별히 bioorthogonal SPAAC/CuAAC 클릭 반응의 순차적 조합을 통해 그것의 자신의 형광 프로브 표시 다음 됩니다. 리그 닌 autofluorescence와 결합,이 방법은 식물 세포 벽 내의 리그 닌의 3 색 지역화 맵 생성 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 고 활성의 유무에 정확한 공간 정보를 제공 합니다. 식물 조직, 세포와 다른 세포 벽 층의 규모에 lignification 기계.
지난 2 년간 화학 기자 전략 역학과 비 유전자 인코딩된 생체의 기능을 조사 하기 위해 강력한 2 단계 방법론으로 떠오르고 있다. 1 , 2 , 3 이 전략에서- 화학 기자 -작은 변조에 대 한 관심의 biomolecule의 합성 아날로그는 먼저 대사 살아있는 유기 체 그리고 화학 조사에 의해 (예., fluorophore 형광에 대 한 confocal 현미경 검사 법 영상) covalently bioorthogonal 클릭 화학을 통해 통합된 기자에 연결 됩니다. 조사 신속 하 고 구체적으로 반응 해야 합니다 생활 시스템에 어떤 생체 불활성 하면서 소개 화학 수정. 많은 방법에서는,이 방법은 그로 인하여 대사 산물 또는 이전 접근 되지 않은 biomacromolecules를 추적 하기 위해 기회를 제공 하는 매우 구체적인 클릭 화학 ligations 사용을 통해 일반적인 bioconjugation 기술의 한계 극복 생활에서 시스템4,,56.
세균 및 동물 세포에이 강력한 방법의 빠른 성장 인기에도 불구 하 고 식물 생물학에 있는 그것의 사용을 설명 하는 보고서는 의외로 몇과7,,89,10, 사이 11,12. 우리는 식물의 리그 닌, 지구상에서 가장 널리 퍼진 biopolymers 중 고 lignocellulosic 바이오 매스의 주요 구성 요소 형성 연구에이 전략을 적용 하는 데 특히 관심이 있었다. 13 , 14 리그 닌 구조와 보호 역할을 하는 개발 및 더 높은 식물의 생활에는 페 놀 폴리머입니다.
그것은 일반적으로 3 4 hydroxyphenylpropanoid moieties 구성 되어있습니다: H (p-hydroxyphenyl), G (guaiacyl)와 S (syringyl) 단위 각각 3에서 파생 된 ‘monolignols’ (p-coumaryl, coniferyl 및 sinapyl 알콜)는 (그림 1) 세포의 세포질에서 phenylpropanoid 통로 통해 합성. 세포 벽에 수출 되 고, 후 monolignols 산화는 peroxidases 또는 laccases 후 그들은 리그 닌 고분자에 유해를 순전히 화학 급진적인 커플링 반응의 받을 래 디 칼, 하는 프로세스 라고 lignification. 15 , 16 비록 lignins 강하게 영향을 많은 식물 유래의 산업용 어 제품, 과학계 아직도 있다 lignification를 규제 하는 복잡 한 메커니즘을 해독 갈 길이.
그림 1: 식물 세포에서 lignification 과정. Monolignols는 cytosol에서 페닐알라닌에서 biosynthesized 있습니다. 세포 벽에 수출 되 고, 후 monolignols 산화는 peroxidases 또는 laccases 후 그들은 리그 닌 고분자에 유해를 순전히 화학 급진적인 커플링 반응의 받을 래 디 칼, 하는 프로세스 라고 lignification. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Glycan 분석 bioorthogonal 반응의 사용에 대 한 보고서는 수많은,2,,317 생체의 다른 종류를 그들의 응용 프로그램 예제는 적은. 리그 닌 bioimaging 목적 bioorthogonal 화학을 사용 하 여 Tobimatsu 그 외 여러분 에 의해 최근에 개척 했다 8 애기 thaliana 알코올 대리 모 알선 리그 닌 고분자 그것은 G 단위, 따라서 개념의 증거를 보여주는8,9 를 형성 하는 어디에 coniferyl의 설립에 대 한 정보를 제공 하는 화학 기자 전략은 이런이 맥락에서 적용 됩니다. CuAAC의 사용은 또한 그림 사용 하 여 다른 coniferyl 알코올 파생 몇 달 나중 Bukowski 외. 그러나 9 , 리그 닌 또한 포함 H와 S 단위 및 lignification 과정의 깊은 이해는 monolignols의 모든 고분자에 통합 하는 방법에 대 한 더 많은 지식이 필요 하 고 어떤 요인 그것의 구성을 제어할 수 있습니다. 현재이 분야에서 새로운 발전은 생활 시스템에서 동시에 여러 화학 기자를 추적 하기 위해 효율적인 방법론의 개발에 따라 달라 집니다. Glycans에 대 한 몇 가지 기사는 최근 몇 년 동안18,19,에 기초를 마련 하더라도20,,2122, 듀얼 접근 라벨 주요 과제 남아 bioorthogonal 화학입니다. 재현할 수 단일 레이블 클릭 프로토콜 개발 어렵다, 다음 듀얼 라벨 접근 상호 2의 연동에 최적화를 필요로 하는 경우 두 명의 별도 화학 기자에 호환 bioorthogonal 반응을 더욱 있습니다. 이 측면을 개척 하는 몇 가지 예 동물 세포에서 glycans 연구 스트레인 승진 아 지 드 alkyne cycloaddition (SPAAC)과 알 켄-tetrazine 역 전자 수요 Diels 오리 나무 (다inv) 반응의 조합 사용. 그러나, 우리는 DAinv 반응의 bioorthogonality (전자-가난한 반응 수 전자 풍부한 대체 cinnamyl 형 단위체를 이루어져 있는 리그 닌의 구조 기능 때문에이 응용 프로그램에서 보장 되지 않을 수 있습니다 생각 DAinv 반응에 사용 되는 tetrazine 프로브 등 dienes)이 아닌 특정 라벨 생성 될 수 있습니다. 다inv 반응 합성으로 액세스로 부피가 고 질 성 그로 인하여 가능성을 제기 하기 어려운 화학 처리를 요구 하는 또한, 그 법인, 전송 그리고/또한 화학 제품의 지역화의 속도 vivo에서 기자 수 있습니다 영향을 받을. 후자의 측면은 lignification을 공부에 대 한 클릭 화학 접근의 경우 특히 관련 된 것으로 간주, 우리는 다른 방향으로 선택 하 고는 Bioorthogonal 결 찰 이미징 순차적 전략 (행복)을 사용 하 여 개발 된 Strain-Promoted 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (SPAAC)와 구리 Catalysed 아 지 드 Alkyne Cycloaddition (CuAAC)의 조합 vivo에서. 23
이 두 반응은 있으며 실제로 두 가지 주요 bioorthogonal 클릭 날짜, 사용 된 반응 특히에서 리그 닌의 몇 가지 예는 이미징 최근에 간행 되었다. 8 , 9 우리의 듀얼 라벨 전략 i) 생물학으로 관련 구조 쪽으로 unreactive, ii) 매우 작은 크기 (그림 2 에 두 개의 화학 처리 한 monolignol 기자에 아 지 드 moiety 및 다른 터미널 alkyne 사용할을 수 있습니다. ). 결과적으로, 이러한 합성 수정 연구 biomolecule의 물리 화학적 특성에 미치는 영향 최소화 호텔측 교통 측면에서 부 자연스럽 고 자연 monolignol 기판 사이 감소 및 metabolization 신진 대사 설립 단계 속도입니다. 비록 SPAAC와 CuAAC의 조합 처음 보면 매우 직관적인 것, 그것은 우리의 지식 구조 glycans 이외에이 전략 및 첫 번째 응용 프로그램을 사용 하 여 이중 표시에만 두 번째 예. 12 , 23
그림 2: 블 리스 듀얼 전략 라벨. 화학 기자 HAZ 와 G 기본 H와 G monolignols의 태그 아날로그는. 그들은 먼저 세 먹이 (1 단계)에 의해 세포 벽의 성장 리그 닌 고분자에 통합 됩니다. Cyclooctyne-와 아 지 드-기능성 형광 프로브는 다음 순차적으로 출혈 통합된 기자에 의해 bioorthogonal 화학 클릭: SPAAC 반응 (단계 2) HAZ 단위의 매우 구체적이 고 뒤에 CuAAC 반응 ( 3 단계) 그는 G 단위 (3 단계)의 특정 되므로 하지 두 기자 들의 특정 지역화 독립적으로 동일한 견본에서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
우리는 첫째로 설계 하 고 유효성을 아 지 드 태그 monolignol 기자 HAZ ( p-coumaryl 알코올의 대리) 및 리그 닌 H 단위의 선구자 다음 그것 함께에서 사용 되는 블 리스 듀얼 레이블 전략 고안에 이전 보고 alkyne 태그 G,9 (coniferyl 알코올의 대리) 및 리그 닌 G 단위의 선구자. 이 재현 프로토콜을 개발 하 고 아마에서 테스트, 경제적으로 중요 한 식물 종, 리그 닌으로 HAZ 와 G 듀얼 대사 설립 먼저 순차 SPAAC/CuAAC 전에 달성은 라벨. 여기, 태그 HAZ 단위는 처음 구체적으로 표시 된 통해 태그 G가 두 번째 형광 프로브 CuAAC 중재 결 찰에 의해 따라 cyclooctyne 기능성된 fluorophore의 SPAAC 결 찰 단위. 이 메서드와 식물 세포 벽 내의 lignification 과정의 역학 조사 하는 데 사용 되었습니다 적용 vivo에서 횡단면, 줄기 종의 서로 다른 식물의 모 종 생활 될 수 있습니다.
앞서 언급 했 듯이,이 문서에 소개 된 듀얼 라벨 블 리스 프로토콜2312, vivo에서SPAAC/CuAAC 결합의 첫 번째 예제 중 하나입니다. 각 단계는 철저 하 게 최적화 및 검증, 그리고 그것은 매우 중요 한 있는 두 클릭 화학 라벨 반응을 순차적으로 수행 하는 순서는 존경 (즉, SPAAC 먼저, 다음에 CuAAC). 모든 크로스-컨트롤 보였다 라벨 각 단계는 특정 때 블 리스 프로토콜 적용된23 : 높은 chemoselective를 처음 리드 SPAAC 단계 수행 HAZ 아 지 드 함수의 라벨은 빠른 속도와 [3 + 2] cycloaddition 반응을 통해 cyclooctyne 기능성된 fluorophore. HAZ 단위 태그는, 일단 아 지 드 fluor 545 프로브 triazole 링크 반응에 의해 생성 하 G가 터미널 alkynes의 copper(I) 촉매 활성화를 필요로 하는 CuAAC 단계 실행 될 수 있습니다. 반면, 역순 (즉, CuAAC 먼저, 다음 SPAAC)가 G HAZ 단위 리드 사용할 수 없습니다 fluorophore 결 찰과 경쟁 하 고 신호의 극적인 손실 유도 크로스 커플링 . 그것은 또한 일반적인 얼룩 피하기 위해 중간 세척 단계의 필요성을 강조 하는 것이 중요입니다.
우리는 우리의 방법은 다양 한 생물학적 실험 디자인을 적용할 수 있습니다 나타났습니다. 블 리스 프로토콜 라벨 먼저 잘라 이전 되었고 클릭 준비 monolignols와 함께 알을 품는 아마 줄기 (약 150-250 µ m 두께)의 자유형 횡단면에 적용 되었습니다. 하지만이 디자인 (외피 볼륨 감소 된다)로 화학 기자의 필요한 수량을 최소화 및 통계 복제의 생산을 촉진의 이점이 있다, 그것은, 엄밀히 말하면, vivo에서 시스템 일부에 경우, 팬 들은 진짜 spatio 시간적 lignification 역학의 모든 측면의 정보를 반영 하지 않을 수 있습니다. 두 번째 실험 설계에서 우리는 따라서 블 리스 프로토콜 이전 소나무와 은행나무27방사선된 monolignols의 연구에 사용 된 방법에 적응. 이 방법에서는, 뿌리와 식물의 줄기는 물리적으로 분리 하 고 전체 줄기의 기지에서 무슨 ‘꽃병’ 접근을 불리 수 있습니다 monolignol 솔루션에 알을 품. 떠난 후 줄기 원하는 (보육) 시간, 횡단면 컷 하 고 수행 하는 블 리스 프로토콜 있습니다. 이 지역화 패턴은 기본적으로 동일 (ii) (i) 수정 된 monolignols 생활 줄기를 통해 수송을 성장 하는 세포 벽 내의 리그 닌 고분자에 통합 표시 허용 접근입니다. 실험의이 유형은 실제 생활 공장에서 수행 되 고의 장점을 / 라이브 셀 더 이상 실험 하 고 더 깊이 있는 연구, 허용 접근 화학 기자의 큰 수량을 요구 한다. 마지막으로, 블 리스 프로토콜도 아마 식물 묘 목, 공장 모델 화학 기자 줄기를 이송 되 고 전에 뿌리를 통해 흡수 되어야 합니다는 살아있는 진짜 대표와 함께 사용 되었다. 이 모델은 실제로, 식물에 수행 되 고의 명확한 이점이 그것 젊은 묘 종에 제한 되며 (긴 보육 시간, 높은 실용적인 이유로 이전 식물 lignification 역학 조사에 정말 적합 하지 않습니다. 화학 기자 양)입니다. 그럼에도 불구 하 고,이 세 가지 실험 디자인은 보완 그리고 모든 실용적인 측면과 답변 생물학 질문의 유형에 따라 생물 학적 의미에 관하여 그들의 장단점 있다.
아마 lignification 역학 연구 개발, 우리의 프로토콜은 높은 적응력, 생물학 실험 디자인의 관점에서 뿐만 아니라 다른 응용 프로그램의 관점에서 식물 종 및 장기/조직. 예를 들어, 블 리스는 애기 또는 다양 한 유전자에 대 한 노크 아웃 또는 노크 다운 뮤턴트와 연구에 더 많은 의무가 있다 Populus 속에 쉽게 전송할 수 있습니다. 원칙적으로, 우리의 접근 방식으로 듀얼 라벨 연구 확장할 수 있습니다 또한 다른 생체에 식물 세포 벽 고분자-모든 세 가지 주요 monolignols 또는 그들의 신진 대사 선구자 뿐만 아니라 다양 한를 포함 하 여 두 가지 수정된 선구자를 사용 하 여 다 당 류 매트릭스를 구성 하는 단 처음 소개 된 이래, bioorthogonal 화학 실제로 주로 개발 되었습니다 통해 대사 처리한후 엔지니어링 (모에)4,5,17,28, glycans/류를 조사 하 하지만 놀랍게도 되었습니다만 거의 응용 생물학 공장 까지는7,8,9,10,,1112. 반응의 호환성 측면에서 리그 닌의 연구 실제로 두 화학 기자는 같은 reticulated 폴리머에 통합으로 해결 하기 위해 복잡 한 사건 이었다. 레이블이 없는 HAZ-의 가능성G가 상호 형성이 했다 G가 와 3D 내 HAZ 단위 공간 근접 때문에 극복 하기 위해 주요 문제 리그 닌23, 않을 수 있습니다 두 명의 화학 기자 포함 되지 않은 경우 동일한 유형의 biopolymer 나 어떤 주어진된 셀의 동일한 공간 영역 제한 구조.
넓은 범위에서 블 리스 방법론 본질적으로 두 가지 화학 기자는 아 지 드와 터미널 alkyne 태그를 각각 베어링을 사용 하 여 세균 이나 동물 모델에서 어떤 두 색 형광 이미징 연구에 적용 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 빚을 연구 연맹 FRABio를 TisBio 이미징 플랫폼 (대학교 릴, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des Assemblages Biomoléculaires) 이것을 달성 하는 데 도움이 되는 기술 환경을 제공 하 작동 합니다.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |