Summary

Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali integrasi-carenti per CRISPR/Cas9-mediata Knockout del Gene nelle cellule in divisione

Published: December 12, 2017
doi:

Summary

Descriviamo la strategia di produzione di vettori lentivirali integrasi-carente (IDLVs) come veicoli per la consegna di CRISPR/Cas9 alle cellule. Con una capacità di mediare rapido e robusto gene modifica nelle celle, IDLVs presentare una più sicura e piattaforma altrettanto efficace vettore per la consegna del gene rispetto ai vettori integrasi-competente.

Abstract

Vettori lentivirali sono la scelta ideale per fornire componenti di modifica del gene delle cellule dovuto la loro capienza per stabile trasducendo un ampio intervallo di celle e alti livelli di espressione genica di mediazione. Tuttavia, la loro capacità di integrarsi nel genoma della cellula ospite aumenta il rischio di mutagenesi inserzionale e quindi solleva preoccupazioni di sicurezza e limita il loro uso nelle regolazioni cliniche. Più ulteriormente, l’espressione persistente della modifica del gene componenti trasportati da questi aumenti di vettori lentivirali integrazione-competente (ICLVs) la probabilità di promiscua gene-targeting. In alternativa, è stata sviluppata una nuova generazione di vettori lentivirali integrasi-carente (IDLVs) che affronta molte di queste preoccupazioni. Qui il protocollo di produzione di una piattaforma IDLV nuova e migliorata per CRISPR-mediata del gene editing ed elenco i passaggi coinvolti nella purificazione e concentrazione di tali vettori è descritto e loro trasduzione e modifica del gene efficienza utilizzando HEK 293T cellule è stata dimostrata. Questo protocollo è facilmente scalabile e può essere utilizzato per generare alto titolo IDLVs che sono in grado di trasdurre cellule in vitro ed in vivo. Inoltre, questo protocollo può essere facilmente adattato per la produzione di ICLVs.

Introduction

Gene preciso editing costituisce la pietra miliare dei principali progressi biomedici che coinvolgono lo sviluppo di nuove strategie per affrontare le malattie genetiche. At l’avanguardia delle tecnologie di modifica del gene è il metodo basandosi sull’uso della clustered regularly –ionterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema di Cas9 che inizialmente è stato identificato come componente dell’immunità batterica contro l’invasione di materiale genetico virale (rivisto in riferimenti1,2). Un grande vantaggio del sistema CRISPR/Cas9 rispetto ad altri strumenti di modifica del gene, quali nucleasi a dita di zinco (ZFNs) e nucleasi di attivatore-come effettore di trascrizione (TALENs) (rivista in riferimento3), è la relativa semplicità del design di plasmide e costruzione di componenti CRISPR — una caratteristica che ha alimentato l’espansione del gene-editing da pochi laboratori specializzati per una comunità di ricerca molto più ampia. Inoltre, la semplicità di programmazione CRISPR/Cas9 e la sua capacità per riconoscimento multiplex target hanno ulteriormente alimentato la sua popolarità come una tecnologia conveniente e facile da usare. Tra i vari metodi disponibili per i ricercatori di consegnare tali componenti modifica del gene delle cellule, vettori virali restano di gran lunga il sistema più popolare ed efficace.

Vettori lentivirali (LVs) sono emersi come il veicolo della scelta per fornire i componenti di CRISPR/Cas9 sistema in vivo per diverse applicazioni4,5,6,7. Diverse caratteristiche chiave rendono LVs una scelta popolare per questo processo inclusa la capacità di infettare sia separazione e divisione di celle, bassa immunogenicità e minima tossicità cellulare (rivisto in riferimento8). Di conseguenza, la terapia genica mediata da LV è stata impiegata nei trattamenti di malattie infettive come l’HIV-1, HBV e HSV-1, come pure nella correzione dei difetti alla base di malattie ereditarie umane, come la fibrosi cistica e degenerazione maculare neo-vascolare 4 , 5 , 7 , 9 , 10 , 11. Inoltre, LVs sono stati modificati in modo efficace per eseguire multisala gene editing presso distinti loci genomici utilizzando un singolo vettore sistema12.

Tuttavia, la proprietà intrinseca di LVs per integrare nel genoma ospite possa essere mutagenica e spesso ostacola la loro utilità come veicoli di consegna del transgene, specialmente nelle regolazioni cliniche. Inoltre, poiché LVs stabilmente integrato esprimono loro transgeni a livelli elevati in modo sostenibile, questo sistema è inadeguato per la consegna del gene di modifica di componenti quali CRISPR/Cas9; sovraespressione di RNA Cas9-guida (gRNA) e di proteine simili come ZFNs, sono associati con i livelli elevati di effetti fuori bersaglio, che comprendono mutazioni indesiderate13,14,15,16 , 17 e può potenzialmente migliorare la citotossicità18. Pertanto, per raggiungere precisi gene-editing con effetti minimi fuori bersaglio, è imperativo per progettare sistemi che consentono l’espressione transitoria del gene componenti editing.

Negli ultimi anni, una varietà di piattaforme di distribuzione sono stati sviluppati per esprimere transitoriamente CRISPR/Cas9 in cellule16,19,20,21 (recensione in riferimento22). Questi includono metodi che si basano sull’introduzione direttamente Cas9 purificata con il RNAs guida appropriata nelle cellule, che è stato indicato per essere più efficace al gene-editing mirato rispetto al plasmide-mediata transfezione16. Gli studi hanno dimostrato che ribonucleoproteina (RNP) complessi costituiti guidano RNA/Cas9 particelle sono girate rapidamente dopo che mediano la fenditura del DNA alle loro destinazioni, suggerendo che a breve termine espressione di questi componenti è sufficiente per raggiungere gene robusto16di editing. In teoria, non integrando piattaforme vettore virale adeno-associato di vettori virali (AAVs) in grado di fornire una valida alternativa per fornire macchinari modifica del gene alle cellule. Purtroppo, capsidi AAV possiedono capacità di imballaggio significativamente più bassa rispetto alla LVs (< 5kb), che ostacola gravemente la loro possibilità di confezionare il toolkit multi-componente CRISPR all'interno di un singolo vettore (rivisto in riferimento8). Vale la pena notare che l’aggiunta di composti che inibiscono istone deacetilasi (ad es., sodio butirrato23) o ostacolare il ciclo cellulare (per esempio, caffeina24) hanno dimostrato di aumentare i titoli lentivirali. Nonostante i recenti progressi, i sistemi di espressione transiente sviluppati finora sono ancora ostacolati da varie carenze, come l’efficienza di produzione inferiore, che portano a titoli virali ridotti e l’efficienza di trasduzione basso dei virus generato attraverso tali approcci25.

Integrasi-carenti vettori lentivirali (IDLVs) rappresentano un avanzamento importante nello sviluppo di veicoli di consegna del gene, come essi combinano la capacità di confezionamento di LVs con il beneficio aggiunto di manutenzione episomal AAV-come nelle cellule. Queste funzionalità consentono di IDLVs in gran parte eludere i problemi principali connessi con l’integrazione di vettori, vis-à-vis continua sovraespressione di potenzialmente genotossici elementi e integrazione-mediata mutagenicità. È stato precedentemente dimostrato che IDLVs possa essere modificata correttamente per migliorare il gene episomal espressione26,27. Per quanto riguarda la consegna di IDLV-mediata CRISPR/Cas9, i titoli di bassa produzione e bassa espressione di genomi episome-sopportate relativi agli impianti lentivirali integrasi-competente limita la loro utilità come strumenti di bona fide per la consegna di modifica del genoma costrutti transgenici. Recentemente abbiamo dimostrato che sia l’espressione del transgene e titoli virali associati IDLV produzione aumentano significativamente con l’inclusione di siti per il fattore di trascrizione Sp1 all’interno l’espressione virale cassetta28di legame. Il IDLVs modificate robustamente supportate CRISPR-mediata del gene editing sia in vitro (in cellule HEK 293T) e in vivo (nei neuroni post-mitotici cervello), mentre induce mutazioni di fuori bersaglio minime rispetto ai corrispondenti ICLV-mediata sistemi28. Nel complesso, abbiamo sviluppato un romanzo, compatto, all-in-one toolkit CRISPR trasportato su una piattaforma IDLV e delineati i vari vantaggi dell’utilizzo di un veicolo di consegna per l’editing avanzato gene.

Qui, il protocollo di produzione del sistema IDLV-CRISPR/Cas9 è descritto, compreso i vari passaggi nell’Assemblea, la purificazione, la concentrazione e la titolazione di IDLVs, nonché strategie per convalidare l’efficacia della modifica del gene di questi vettori. Questo protocollo è facilmente scalabile per soddisfare le esigenze di diversi ricercatori ed è progettato per generare dei vettori-LV con i titoli con successo nella gamma di 1 x 1010 transducing unità (TU) / mL. I vettori generati attraverso questo protocollo possono essere utilizzati per infettare in modo efficiente diversi tipi di cellule diverse, tra cui difficile per trasdurre staminali embrionali, cellule ematopoietiche (cellule T e macrofagi) e coltivate e vivo in– neuroni iniettati. Inoltre, il protocollo è ugualmente adatto per la produzione di vettori lentivirali integrasi-competente in quantità simili.

Figure 1
Figura 1: imballaggio di IDLV. (a) schema di tipo selvaggio dell’integrasi proteina (b) il plasmide modificato è stato derivato da psPAX2 (vedere Metodi, costruzione del plasmide per dettagli). Immagine di gel di agarosio rappresentante dei cloni schermati per cloni mutati integrasi. Campioni di DNA preparati utilizzando un mini-kit di isolamento del DNA del plasmide standard sono stati analizzati tramite digestione con EcoRV e SphI. Il clone correttamente digerito (numero 5, casella rossa tratteggiata) è stata ulteriormente verificato mediante sequenziamento diretto (Sanger) per la sostituzione di D64E in INT. La cassetta di imballaggio dell’integrasi-carente è stata denominata pBK43. (c) schema del protocollo trasfezione transiente impiegato per generare dei vettori-IDLV-CRISPR/Cas9, mostrando 293T cellule trasfettate con VSV-G, imballaggi e cassette transgene (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-one plasmide). Le particelle virali che bud fuori dalla membrana cellulare contengono il RNA Full-Length del vettore (espresso dal cassetto transgene). La seconda generazione del IDLV-packaging system è stata utilizzata, che comprende le proteine regolarici Tat ed espressione Rev Rev. è inoltre integrata da una cassetta separata (RSV-REV-plasmide). Abbrev: virus di stomatite vescicolare ripetere, VSV-G, LTR-Long-terminale G-proteina, promotore pCMV-citomegalovirus; Promotore di Rous sarcoma virus (RSV); RRE-(elemento di risposta Rev). Altri elementi regolatori della cassetta di espressione comprendono siti di legame per Sp1, elemento Rev Response (RRE), marmotta epatite Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE), promotore di un nucleo-allungamento fattore 1 α (EFS-NC), l’imballaggio di vettore elemento ψ (psi), promotore umano di citomegalovirus (hCMV) e promotore umano U6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. coltura delle cellule HEK 293T e semina di cellule per la transfezione Nota: Rene embrionale umano 293T cellule (HEK 293T) sono coltivate in DMEM, media alto glucosio completato con siero di vitello 10% completato con promotori di crescita e di ferro e 1 x soluzione antibiotico antimicotico (100 x soluzione contiene penicillina di 10.000 unità la streptomicina 10 mg e 25 µ g amfotericina B / mL). I mezzi di comunicazione è anche completato con 1 x sodio piruvato, mix di aminoacidi non esse…

Representative Results

Convalida dell’eliminazione diretta-efficienza dei vettori IDLV-CRISPR/Cas9Abbiamo usato cellule 293T che esprimono GFP come un modello per convalidare l’efficienza di knockout di gene CRISPR/Cas9-mediata. Cellule GFP + sono state generate da trasduzione delle cellule HEK 293T con pLenti-GFP (vBK201a) presso un MOI di 0,5 (Figura 3b, pannello di “no-virus”). La cassetta di sgRNA-a-GFP/Cas9 all-in-one vector è stata confezionata in partic…

Discussion

IDLVs hanno cominciato ad emergere come il veicolo della scelta per in vivo gene-editing, soprattutto nel contesto delle malattie genetiche, in gran parte a causa del basso rischio di mutagenesi associata con questi vettori rispetto all’integrazione di piattaforme di consegna22 , 28. nel manoscritto attuale, abbiamo cercato di dettagliare il protocollo associato alla produzione del migliore sistema IDLV-CRISPR/Cas9 all-in-one che recentemente è stato sv…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il dipartimento di neurobiologia, Duke University School of Medicine e del decanato per scienza di base, Duke University. Ringraziamo anche i membri del nucleo vettore virale Duke per commenti sul manoscritto. Plasmide pLenti CRISPRv2 era regalo da Feng Zhang (Broad Institute). Il sistema di LV-imballaggio tra cui il psPAX2 di plasmidi, VSV-G, pMD2.G e OSPRO-Rev è stato un regalo gentile da Didier Trono (EPFL, Svizzera). Sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito dall’Università di South Carolina School Of Medicine, concedere RDF18080-E202 (Bambi).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
xMark Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
BD FACS Becton Dickinson 338960
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor Beckman Coulter 369650
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
High-binding 96-well plates Corning 3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Tissue culture pipettes, 5 mL Corning 4487
Tissue culture pipettes, 10 mL Corning 4488
Tissue culture pipettes, 25 mL Corning 4489
Hemacytometer with cover slips Cole-Parmer UX-79001-00
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
DMEM, high glucose media Gibco 11965
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid) Sigma Aldrich B9879 – BES
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
pRSV-Rev Addgene 12253
lentiCRISPR v2 Addgene 52961
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsrGI New England Biolabs R0575S
BsmBI New England Biolabs R0580S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

Referenzen

  1. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  2. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
  3. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  4. Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
  5. Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
  6. Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
  7. Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
  8. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
  9. Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
  10. Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
  11. Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
  12. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
  13. Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
  14. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  15. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  16. Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
  17. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  18. Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
  19. Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  22. Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
  23. Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
  24. Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
  25. Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
  26. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  27. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  28. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
  29. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
  30. Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
  31. Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
  32. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  33. Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
  34. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  35. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  36. Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
  37. . Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products – Revisiting Current FDA Recommendations Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017)
  38. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017)
  39. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  40. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  41. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  42. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).

View Video