CRISPR/Cas9-מתווכת אינטגרציה יישוב In Vivo באמצעות אסטרטגיה מבוסס על הצטרפות סוף בתיווך הומולוגיה
Summary
באופן קבוע באשכולות interspaced חלבון קצר palindromic חזרה/CRISPR הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) מערכת מספקת כלי מבטיח עבור הנדסה גנטית, ופותחת לו את האפשרות של שילוב יישוב של transgenes. אנו מתארים קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה עבור DNA יעיל ממוקד אינטגרציה ויוו , ממוקד ג’ין טיפולים באמצעות CRISPR/Cas9.
Abstract
כפלטפורמה מבטיח הגנום העריכה, מערכת CRISPR/Cas9 יש פוטנציאל גדול עבור הנדסה גנטית יעיל, במיוחד לשילוב יישוב של transgenes. עם זאת, בשל יעילות נמוכה רקומבינציה הומולוגית (HR) ואת מוטציות שונות ויאסין של קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ)-מבוסס אסטרטגיות-חלוקת תאים, ויוו הגנום עריכה נשאר אתגר גדול. כאן, אנו מתארים את קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-CRISPR/Cas9 מערכת לשילוב יעיל ויוו מדויק יישוב מבוססת. במערכת זו, הגנום יישוב, התורם וקטור המכיל הומולוגיה זרועות (~ 800 bp) ולצדו היעד RNA (sgRNA) מדריך בודד רצפים הם ביקע מאת CRISPR/Cas9. אסטרטגיה זו מבוססת על HMEJ משיגה שילוב יעיל transgene העכבר מופרות, וכן hepatocytes ויוו. יתר על כן, אסטרטגיה מבוסס-HMEJ מציעה גישה יעילה עבור תיקון של fumarylacetoacetate ההידרולז (Fah) מוטציה ב- hepatocytes ואת מציל Fah-מחסור המושרה כשל בכבד עכברים. יחדיו, התמקדות ממוקד אינטגרציה, אסטרטגיה זו מבוססת-HMEJ מספק כלי מבטיח עבור מגוון של יישומים, כולל דור של מודלים מהונדס גנטית וטיפולים ג’ין יישוב.
Introduction
עריכה מדויקת, ממוקד הגנום נדרש לעיתים קרובות לייצור מודלים מהונדס גנטית וטיפולים רפואיים. הרבה מאמץ לפתח אסטרטגיות שונות עבור יעיל הגנום יישוב עריכה, כגון אבץ אצבע נוקלאז (ZFN), nucleases אפקטור כמו מפעיל שעתוק (TALENs), ומערכות CRISPR/Cas9. אסטרטגיות אלה ליצור מעברי כפול-גדיל DNA יישוב (DSB) הגנום, ולנצל מהותי מערכות תיקון ה-DNA, כגון1,רקומבינציה הומולוגית (HR)2, בתיווך microhomology סוף מצטרף (MMEJ)3 , 4 , 5ולאחר סיום שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ)6,7,8 כדי לעודד אינטגרציה יישוב של1,transgenes9. האסטרטגיה מבוססת-HR נמצא כעת הכי נפוץ הגנום עריכה הגישה, אשר יעילה מאוד של שורות תאים, אבל לא נגיש ללא חלוקת תאים בשל התרחשותו מוגבלת בשלב S/G2 מאוחר. לפיכך, האסטרטגיה מבוססת-HR אינה ישימה עבור ויוו עריכה הגנום. לאחרונה, האסטרטגיה מבוססת NHEJ פותחה עבור ג’ין יעיל טוק ב- העכבר רקמות8. למרות זאת, השיטה מבוססת NHEJ מציג בדרך כלל indels בצמתים, ומקשה להפיק הגנום מדויק עריכה, במיוחד כאשר מנסים לבנות במסגרת פיוז’ן גנים8. שילוב יישוב מבוסס-MMEJ הוא מסוגל הגנום מדויק עריכה. עם זאת, רק בצניעות מגבירה את יעילות שילוב יישוב דוחות קודמים5. לכן, שיפור היעילות של אינטגרציה יישוב מדויק ויוו דרושה עבור יישומים טיפולית רחבה3.
בעבודה שפורסמה לאחרונה, הפגנו קצה בתיווך הומולוגיה להצטרף (HMEJ)-המבוססת על אסטרטגיה, אשר הראו את היעילות הגבוהה ביותר אינטגרציה יישוב כל דיווח אסטרטגיות בשני במבחנה , ויוו10. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להקמתה של מערכת HMEJ, הבנייה של הווקטורים RNA (sgRNA) יחיד-מדריך מיקוד הגן של עניין התורם המומנט מחסה אתרי היעד sgRNA ו ~ 800 bp הומולוגיה נשק (איור 1) . ב פרוטוקול זה, אנו גם מתארים את השלבים המפורטים עבור הדור של ה-DNA טוק-אין עכברים של צעדים קצרים לשילוב יישוב רקמות ויוו. יתר על כן, מחקר הוכחה הרעיון של האסטרטגיה מבוססת HMEJ הוכיח את יכולתו לתקן Fah מוטציה והצלה Fah– / – כבד כשל עכברים, אשר חשף עוד יותר את הפוטנציאל הטיפולי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בבנייה של פלסמידים התורם HMEJ הם: (1) מבחר sgRNA עם יעילות גבוהה של ביקוע DNA והמרחק נמוך בין אתר חיתוך sgRNA, stop codon ובניית (2) נכונה HMEJ התורם. CRISPR/Cas9-מתווכת המחשוף בנתיב התורם הן transgene (מכיל אתרי היעד sgRNA והזרועות הומולוגיה bp ~ 800) ואת הגנום יישוב נחוץ לשם שילוב יעיל ומדויק יישוב ו…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי רשויות אישורים אסטרטגי עדיפות תכנית המחקר (XDB02050007, XDA01010409), ה-Hightech R הלאומית & תוכנית D (תוכנית 863; 2015AA020307), קרן מדעי הטבע הלאומי של סין (NSFC מעניקה 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), סין הנוער אלפי התוכנית כישורים (להיי), או באמצעות פרויקט של האקדמיה הסינית למדעים, שנחאי העיר ועדת המדע והטכנולוגיה פרויקט (16JC1420202 להיי), משרד המדע, הטכנולוגיה של סין (רוב; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
Referenzen
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
