Enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos N-terminal para la determinación estructural por espectrometría de masas
Summary
El enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas con una fase de tensioactivo no iónico, método de partición se describe para su uso directo en los ensayos de TLR u otras aplicaciones. Otras medidas se detallan para preparar N-terminal tríptico lipopéptidos caracterización estructural por espectrometría de masas.
Abstract
Las lipoproteínas son importantes componentes de la envoltura celular bacteriana y potentes activadores de la respuesta inmunitaria innata mamífera. A pesar de su importancia para la fisiología celular e Inmunología, queda mucho por descubrir el efecto de las distintas formas sobre la inmunidad del anfitrión, cómo se sintetizan y lipoproteína novedosas formas. Para permitir estudios cuidadosos en las lipoproteínas, este protocolo describe un método para el enriquecimiento de lipoproteínas bacterianas y preparación de lipopéptidos tríptico N-terminal para la determinación estructural por láser de matriz asistida por desorción de ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS). Expansión en una fase de Tritón X-114 establecida repartir método para la extracción de la lipoproteína y enriquecimiento de la membrana celular bacteriana, el protocolo incluye medidas adicionales para eliminar contaminantes no-lipoproteína, aumentar la producción de lipoproteínas y pureza. Puesto que las lipoproteínas son comúnmente utilizadas en ensayos de Toll-like receptor (TLR), es fundamental primero caracterizar la estructura del N-terminal por MALDI-TOF MS. adjunto, se presenta un método para aislar péptidos hidrofóbicos concentrados enriquecidos en N-terminal lipopéptidos de directo análisis por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que se han separado por electroforesis en Gel poli-acrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, digerido en situ con tripsina, secuencialmente se lava para quitar polar péptidos trípticos y finalmente se eluyeron con Cloroformo-metanol. Cuando se combina con MS de los péptidos más polares de trypsinized de soluciones de lavado, este método proporciona la capacidad para identificar la lipoproteína y caracterizar su N-terminal en un solo experimento. Sodio intencional aducción formación también puede ser empleado como una herramienta para promover más espectros de fragmentación estructural informativo. En última instancia, el enriquecimiento de lipoproteínas y determinación de sus estructuras del N-terminal permitirá estudios más extensos en esta clase ubicua de proteínas bacterianas.
Introduction
Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por una conservada N-terminal modificada en lípidos cisteína que ancla el dominio globular de la proteína a la superficie de la membrana de la célula. Están distribuidos universalmente en las bacterias, constituyendo el 2 y el 5% de todos los genes celulares dentro de un genoma típico1. Las lipoproteínas juegan un papel crítico en una amplia variedad de procesos celulares, incluyendo la absorción de los nutrientes, transducción de señales, montaje de complejos de proteínas y en el mantenimiento de la célula envolvente integridad estructural2. En bacterias patógenas, las lipoproteínas sirven como factores de virulencia3,4. Durante una infección, reconocimiento de lipopéptidos N-terminal por Toll-like receptor (TLR) 2 genera una respuesta inmune innata para eliminar patógenos invasores. Dependiendo del estado de acilación del N-terminal, las lipoproteínas son reconocidas generalmente por alternativos complejos heterodiméricos de TLR2. TLR1 TLR2 reconoce N-acilados lipopéptidos, mientras que TLR2-TLR6 ATA gratis Lipopéptido termini α-amino. Una vez enlazado, convergen las vías de señalización para inducir la secreción de proinflammatory cytokines3,4.
Se pensaba que las lipoproteínas de bacterias Gram-positivas eran diacylated y los de bacterias Gram-negativas triacylated, difiriendo en la ausencia o presencia de un ácido graso amida vinculados a los residuos conservados de cisteína N-terminal. Esta hipótesis fue apoyada por la falta de secuencia ortólogos en Gram-positivas genomas a Lnt, la Gram negativos N-acil transferasa que forma de lipoproteínas triacylated5. Sin embargo, estudios recientes han revelado triacylation lipoproteína en Gram-positivas Firmicutes falta lnt, así como tres nuevos N-terminal lipoproteína estructuras, denominadas la peptidil lyso y N –acetil formas6,7 ,8. Estos resultados plantean cuestiones sobre formas posible lipoproteína con todo descubierto, junto a preguntas fundamentales acerca de cómo se hacen estas lipoproteínas novela y qué propósito fisiológico o ventaja imparten las distintas formas. Además, claramente demuestran la incapacidad actual de la genómica para predecir la estructura de la lipoproteína. De hecho, recientemente se identificaron una nueva clase de transferasas de N-acil de lipoproteína, llamado Lit, de Enterococcus faecalis y Bacillus cereus que hace forma de lyso lipoproteínas9. Esto indica la necesidad de verificar experimentalmente la estructura de la lipoproteína, que puede ser difícil debido a su naturaleza extremadamente hidrofóbica y métodos limitados disponibles para caracterizar su estructura molecular.
Para facilitar los estudios sobre la inducción de la lipoproteína de la inmunorespuesta del anfitrión, así como la determinación estructural del N-terminal, hemos adaptado varios protocolos descritos previamente para purificar las lipoproteínas bacterianas y preparar el caso del N-terminal lipopéptidos para análisis por MALDI-TOF MS6,10,11,12. Las lipoproteínas están enriquecidas con una fase de X-114 de Tritón (en adelante denominado surfactante o TX-114) establecida repartir método, con optimización para eliminar contaminantes no-lipoproteínas y aumentar la producción de lipoproteína. Estas lipoproteínas son aptos para su uso directo en los ensayos de TLR o para su posterior purificación por SDS-PAGE. MALDI-TOF MS, transferencia de lipoproteínas de las membrana de nitrocelulosa proporciona un andamio para eficiente en situ la digestión de la tripsina, lavado y elución posterior de la superficie de la membrana, resultando altamente purificada lipopéptidos N-terminal. Nitrocelulosa se ha demostrado para facilitar el manejo de la muestra y mejorar la cobertura de la secuencia de péptidos altamente hidrofóbicos de las proteínas de membrana integral13,14, así como las lipoproteínas9,10 . El método tiene la ventaja adicional de fraccionamiento péptidos basados en polaridad, para que soluciones de lavado intermedio pueden ser analizadas para identificación de proteínas de alta confianza simultáneamente con determinación estructural N-terminal en un solo experimento . Presente Protocolo únicamente sodio intencional características aducción formación para promover la fragmentación de iones de padre hacia los iones dehydroalanyl en MS/MS, ayudar en la asignación estructural de estado N– acilación. N-terminal es la característica más variable y clave relacionados con el reconocimiento TLR de las lipoproteínas. Tomados en conjunto, este protocolo ha permitido estudios intensivos y reproducibles en las lipoproteínas, de las fases individuales de la purificación y determinación estructural por MALDI-TOF MS fácilmente adaptada dependiendo del objetivo del experimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo en el presente documento describe dos etapas distintas de la caracterización de la lipoproteína: determinación estructural y particionada por MALDI-TOF MS de la fase de enriquecimiento por TX-114. Durante TX-114 extracción, centrifugación adicional elimina proteínas contaminantes que precipitan durante este proceso, seguido por la precipitación de acetona para producir lipoproteínas muy enriquecidas. Limitando la magnitud de cada preparación valor 15 mL de las células, varias muestras pueden ser f?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación en el laboratorio de Meredith fue apoyada por fondos de arranque proporcionados por la Facultad de Ciencias de Eberly (Pennsylvania State University). Agradecemos a Dr. Tatiana Laremore para asesoramiento técnico y el acceso al equipo en la proteómica de estado de Penn e instalaciones de centrales de espectrometría de masa, University Park, PA, donde se realizaron análisis de espectrometría de masa.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
Referenzen
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
