Обогащение бактериальных липопротеинов и подготовка N-терминальный Lipopeptides структурные определения по масс-спектрометрии
Summary
Обогащение бактериальной липопротеинов с использованием фазы неионных ПАВ, секционирование метод описан для прямого использования в TLR анализов или других приложений. Дальнейшие шаги подробно подготовить tryptic lipopeptides N-терминала для структурных характеристик по масс-спектрометрии.
Abstract
Липопротеины являются мощным активаторы млекопитающих врожденный иммунный ответ и важные составляющие конверт бактериальной клетки. Несмотря на их значение для физиологии клетки и иммунологии предстоит быть обнаружены формы роман липопротеинов, как они синтезируются и влияние различных форм на хост иммунитета. Чтобы включить тщательные исследования на липопротеинов, этот протокол описывает метод для обогащения бактериальных липопротеинов и подготовка tryptic lipopeptides N-терминальный структурные определения матрицы с помощью лазерной десорбции ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS). Расширение на установленных Тритон X-114 фазы, секционирование метод липопротеинов добычи и обогащения от бактериальных клеточных мембран, протокол включает дополнительные шаги для удаления загрязнений-липопротеиды, увеличивая урожайности липопротеинов и чистоты. Так как липопротеинов широко используются в Толл подобный рецептор (TLR) анализов, важно сначала охарактеризовать структуру N-стержня, г-жа MALDI-TOF здесь, изолировать концентрированной гидрофобные пептиды, обогащенный в N-терминальный представлен метод lipopeptides подходит для прямого анализа MALDI-TOF MS/жа липопротеинов, отделяющий натрия Додециловый сульфат-Полимерность электрофорез геля (SDS-PAGE) передаются на нитроцеллюлозную мембрану, усваивается в situ с трипсин, последовательно промывают для удаления полярных tryptic пептидов и наконец этого eluted хлороформ-метанола. В сочетании с MS более полярных trypsinized пептидов из Вымойте решения, этот метод обеспечивает возможность выявления липопротеинов и характеризуют его N-terminus в одном эксперименте. Преднамеренное натрия аддукт формирования также могут использоваться как инструмент для поощрения более структурно информативный фрагментации спектров. В конечном счете обогащение липопротеинов и определение структуры их N-терминала позволит более обширные исследования на этот вездесущий класса бактериальных белков.
Introduction
Бактериальные липопротеинов характеризуются сохранены N-терминальный липидного изменено хвоща, который закрепляет домена глобулярных белков на поверхности клеточной мембраны. Они распределены повсеместно в бактерии, составляют 2-5% всех клеточных генов в течение типичного генома1. Липопротеиды играют решающую роль в самых разнообразных клеточных процессов, включая поглощение питательных веществ, сигнальной трансдукции телефоны, Ассамблея белковых комплексов и в поддержании конверт структурной целостности2. В патогенных бактерий липопротеинов служат факторы вирулентности3,4. Во время инфекции признание lipopeptides N-стержня, Толл подобный рецептор (TLR) 2 подстрекает врожденный иммунный ответ для удаления вторжение патогенов. В зависимости от состояния ацилирования N-стержня липопротеинов распознаются как правило альтернативные TLR2 гетеродимерная комплексов. TLR2-TLR1 признает N-ацилированных lipopeptides, хотя TLR2-TLR6 связывает свободный липопептиды α-аминокислоты Термини. Один раз связанный, сигнальные пути сходятся побудить секрецию провоспалительных цитокинов3,4.
Ранее считалось, что липопротеинов от грамположительные бактерии были diacylated и те от грамотрицательных бактерий triacylated, отличаясь в отсутствие или наличие связаны Амида жирной кислоты на сохранившихся остатков цистеина N-терминала. Это предположение было поддержано отсутствие последовательности Ортологи в грамположительных геномы Lnt, трансферазы грамотрицательные N-ацил, которая формирует triacylated липопротеины5. Однако недавние исследования показали, triacylation липопротеинов в грамположительных Фирмикуты что отсутствие lnt, а также три романа структуры N-терминальный липопротеинов, называют peptidyl, lyso и N –ацетил формы6,7 ,8. Эти результаты поднимают вопросы о формах можно еще к быть обнаружил липопротеинов, наряду с основополагающие вопросы о том, как эти Роман липопротеинов и какие физиологические цели или преимущество распространять различные формы. Кроме того они наглядно демонстрируют геномики текущего невозможность предсказать структуру липопротеинов. Действительно мы недавно выявили новый класс липопротеинов N-ацил трансферазы, называется Lit, Enterococcus faecalis и Bacillus cereus , что делает lyso форма липопротеинов9. Это указывает на необходимость экспериментально проверить липопротеинов структуры, которая может быть сложным из-за их чрезвычайно гидрофобная природа и ограниченные методы, доступные для характеризовать их молекулярной структуры.
Для облегчения исследований по индукции липопротеинов иммунного ответа, а также структурные определения N-терминала, мы адаптировали несколько ранее описанные протоколы для того чтобы очистить бактериальных липопротеинов и подготовить tryptic N-терминальный lipopeptides для анализа MALDI-TOF MS6,10,,1112. Липопротеины обогащаются с использованием установленных Тритон X-114 (отныне именуемой ПАВ или TX-114) фазы, секционирование метод, с оптимизацией для удаления загрязняющих non липопротеинов и увеличить урожайность липопротеинов. Эти липопротеинов пригодны для непосредственного использования в TLR анализов или для дальнейшей очистки, SDS-PAGE. Для MALDI-TOF MS передачи липопротеинов нитроцеллюлозную мембрану обеспечивает леску для эффективного в situ Пищеварение трипсина, мытье, и последующие элюции от поверхности мембраны, что приводит к весьма очищенный N-терминала lipopeptides. Нитроцеллюлоза было показано, чтобы облегчить пробами и улучшить освещение последовательности для высокой гидрофобностью пептидов из составной мембранных белков13,14, а также липопротеинов9,10 . Метод имеет дополнительное преимущество, фракционирования пептиды, основанные на полярности, так что промежуточные Вымойте решения могут быть проанализированы для идентификации белков высокого доверия одновременно с N-терминальный структурные определения в одном эксперименте . Этот протокол уникально возможности преднамеренного натрия аддукт формирования способствовать фрагментации Ион родителя к dehydroalanyl ионов во время МС/МС, пособничество в структурной назначение государства – ацилирования N. N-го является наиболее переменных и ключевых функций, связанных с признанием TLR липопротеинов. Вместе взятые, этот протокол позволил интенсивной и воспроизводимости исследований на липопротеинов, с отдельные этапы очищения и структурные определения MALDI-TOF MS легко адаптированы в зависимости от общей цели эксперимента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь протокол описывает два отдельных этапов липопротеинов характеристика: обогащение TX-114 фаза перегородки и структурные определения MALDI-TOF MS. Во время извлечения TX-114 дополнительные центрифугирования удаляет загрязняясь протеины, которые осадок во время этого процесса, следуют ацет…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в лаборатории Мередит был поддержан запуска средств, предоставленных Эберли Колледж естественных наук (Университет штата Пенсильвания). Мы благодарим д-р Татьяна Laremore для технических экспертов и доступа к оборудованию на Пенн государства протеомики и масс спектрометрии основного фонда, Юниверсити-Парк, штат Пенсильвания, где Массовый спектрометрический анализы.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
Referenzen
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
