Enrichissement des lipoprotéines bactériennes et préparation des Lipopeptides N-terminal pour la détermination de structure par spectrométrie de masse

Lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par une conservée cystéine des lipides modifiés de N-terminal qui ancre le domaine protéine globulaire à la surface de la membrane cellulaire. Ils sont universellement distribués chez les bactéries, qui constituent 2 à 5 % de tous les gènes cellulaires au sein d’un génome typique¹. Assemblée de complexes protéiques et dans le maintien de cellules enveloppe intégrité structurale², lipoprotéines jouent un rôle crucial dans une grande variété de processus cellulaires, notamment l’absorption des éléments nutritifs, transduction du signal. Chez les bactéries pathogènes, lipoprotéines servent de facteurs de virulence^3,4. Lors d’une infection, reconnaissance des lipopeptides N-terminale de récepteur Toll-like (TLR) 2 incite à une réaction immunitaire innée pour éliminer les pathogènes envahisseurs. Selon l’état de l’acylation N-terminale, lipoprotéines sont généralement reconnus par le remplaçant TLR2 hétérodimérique complexes. TLR2-TLR1 reconnaît N-acylés lipopeptides, tandis que TLR2-TLR6 lie lipopeptide libre α-aminé termini. Une fois lié, les voies de signalisation convergent pour induire la sécrétion de proinflammatory cytokines^3,4.

On pensait auparavant que lipoprotéines de bactéries Gram-positives ont été diacylated et ceux des bactéries à Gram négatif triacylated, différant par l’absence ou la présence d’un acide gras amidé sur le résidu de cystéine N-terminale conservé. Cette hypothèse a été soutenue par l’absence de séquences orthologues dans les génomes de Lnt, la transférase de N-acyl-Gram négatif qui forme triacylated lipoprotéines⁵Gram positifs. Cependant, des études récentes ont révélé triacylation lipoprotéine dans Firmicutes Gram positif que manque lnt, ainsi que trois structures de lipoprotéines N-terminal roman, appelés la peptidyl, lyso et N –acétyl formes^{6,7 ,},⁸. Ces résultats soulèvent des questions sur les formulaires de lipoprotéine d’encore-à-être-découvert possible, aux côtés des questions fondamentales sur comment ces nouvelles lipoprotéines sont faites et quel but physiologique ou avantage répandre des diverses formes. En outre, ils démontrent clairement l’incapacité actuelle de la génomique pour prédire la structure de lipoprotéines. En effet, nous avons récemment identifié une nouvelle classe de transférase de N-acyl-lipoprotéine, appelé Lit, Enterococcus faecalis et Bacillus cereus qui rend lyso-formulaire lipoprotéines⁹. Ceci indique la nécessité de vérifier expérimentalement la structure de lipoprotéines, qui peut s’avérer difficile en raison de leur nature extrêmement hydrophobe et limitée des méthodes permettant de caractériser leur structure moléculaire.

Pour faciliter les études sur l’induction de la réponse immunitaire de l’hôte, ainsi que la détermination structurale N-terminal de lipoprotéine, nous avons adapté plusieurs protocoles décrits précédemment afin de purifier les lipoprotéines bactériennes et préparer le tryptique N-terminal lipopeptides pour analyse par MALDI-TOF MS^6,10,11,12. Les lipoprotéines sont enrichis en utilisant une phase de X-114 Triton (désormais dénommé surfactant ou TX-114) établie partitionnement méthode, avec optimisation pour enlever les contaminants non-lipoprotéines et augmenter le rendement de la lipoprotéine. Ces lipoprotéines sont appropriés pour une utilisation directe dans des essais de TLR ou pour davantage de purification par SDS-PAGE. Pour MALDI-TOF MS, transfert des lipoprotéines de membrane de nitrocellulose fournit un échafaudage pour efficace in situ la digestion trypsique, lavage et élution subséquente de la surface de la membrane, ce qui entraîne très purifiée lipopeptides N-terminale. Nitrocellulose a été établi pour faciliter la manipulation des échantillons et améliorer la couverture de séquence pour les peptides fortement hydrophobes de l’intégrale de membrane protéines^13,14, ainsi que les lipoprotéines^9,10 . La méthode a l’avantage supplémentaire de fractionnement des peptides basées sur la polarité, afin que des solutions de lavage intermédiaire peuvent être analysées pour l’identification de protéines de haute confiance en même temps que la détermination de structure N-terminale dans une expérience simple . Ce protocole unique sodium intentionnelle caractéristiques la formation d’adduits à promouvoir la fragilisation d’ion parent vers dehydroalanyl ions pendant MS/MS, aidant à affectation structurelle de l’état d’acylation – N. L’extrémité N-terminale est deux la fonctionnalité plus variable et clée liée à la reconnaissance TLR des lipoprotéines. Pris ensemble, ce protocole a permis des études intensives et reproductibles sur les lipoprotéines, les différentes étapes de purification et de la détermination de structure par MALDI-TOF MS facilement adapté selon l’objectif global de l’expérience.