Verrijking van Lipoproteins van de bacteriële en de bereiding van N-terminal Lipopeptides voor structurele bepaling door massaspectrometrie

Lipoproteins van de bacteriële worden gekenmerkt door een geconserveerde N-terminale lipide gemodificeerde cysteïne die ankers van het domein van de bolvormige eiwit op het oppervlak van de celmembraan. Ze zijn universeel verspreid in bacteriën, die 2 tot 5% van alle cellulaire genen binnen een typisch genoom¹. Lipoproteins van de spelen een kritieke rol in een grote verscheidenheid van cellulaire processen, waaronder de opname van de voedingsstoffen, signaaltransductie, vergadering van eiwitcomplexen, en ter handhaving cel envelop structurele integriteit². Pathogene bacteriën dienen lipoproteïnen als virulentie factoren^3,4. Erkenning van N-terminal lipopeptides door Toll-like receptor (TLR) 2 aanzet tijdens een infectie, een aangeboren immune reactie op het verwijderen van de invasie ziekteverwekkers. Afhankelijk van de N-terminale acylering staat, zijn de lipoproteïnen algemeen erkend door alternatieve TLR2 heterodimeric complexen. TLR2-TLR1 herkent N-GEACYLEERDE lipopeptides, terwijl TLR2-TLR6 bindt gratis lipopeptide α-amino termini. Eenmaal gebonden, samenkomen de signaalroutes om te induceren secretie van proinflammatoire cytokines^3,4.

Eerder werd gedacht dat lipoproteins van gram-positieve bacteriën waren diacylated en die van gram-negatieve bacteriën triacylated, die verschillen in de afwezigheid of de aanwezigheid van een vetzuur amide-linked op het geconserveerde N-terminale cysteine residu. Deze veronderstelling werd gesteund door het ontbreken van reeks orthologs in gram-positieve genoom te Lnt, de gram-negatieve N-acyl-transferase die triacylated lipoproteïnen⁵vormt. Echter, recente studies is gebleken dat lipoproteïne triacylation in gram-positieve Firmicutes die ontbreken lnt, evenals drie nieuwe N-terminale lipoproteïne structuren, genoemd de peptide, lyso en N –acetyl vormen^{6,7 ,8}. Deze bevindingen stellen vragen over mogelijk nog-te-worden-ontdekt lipoproteïne vormen, naast het fundamentele vragen over de manier waarop deze roman lipoproteins worden gemaakt en welke fysiologische doel of voordeel de verschillende vormen geven. Bovendien tonen zij duidelijk aan het huidige onvermogen van de genomica te voorspellen lipoproteïne structuur. Inderdaad, we onlangs geïdentificeerd een nieuwe klasse van lipoproteïne N-acyl enzym, genaamd Lit, van Enterococcus faecalis en Bacillus cereus , dat lyso-formulier lipoproteïnen^{9 maakt}. Dit wijst op de noodzaak om het experimenteel verifiëren lipoproteïne structuur, die uitdagend vanwege hun zeer hydrofobe aard en de beperkte methoden beschikbaar worden kan voor het karakteriseren van hun moleculaire structuur.

Ter vergemakkelijking van studies over lipoproteïne inductie van de immuunrespons van de gastheer, alsook de structurele vaststelling van N-terminale, hebben we verschillende eerder beschreven protocollen om te zuiveren lipoproteins van de bacteriële en de voorbereiding van de N-terminale al aangepast lipopeptides voor analyse door MALDI-TOF MS^6,10,11,12. Lipoproteïnen zijn verrijkt met behulp van een gevestigde Triton X-114 (voortaan aangeduid als oppervlakteactieve stof of TX-114) fase partitioneren methode, met optimalisatie lipoproteïne opbrengst te verwijderen van contaminerende niet-lipoproteïnen. Deze lipoproteins zijn geschikt voor direct gebruik in TLR testen of voor verdere zuivering door SDS-PAGE. Voor MALDI-TOF MS, overdracht van de lipoproteïnen aan het membraan van het nitrocellulose voorziet een steiger efficiënt in situ de spijsvertering van de trypsine, wassen en latere elutie van het oppervlak van de membraan, resulterend in sterk gezuiverd N-terminal lipopeptides. Nitrocellulose is aangetoond dat het oog op het hanteren van de steekproef en verbetering van de reeks dekking voor zeer hydrofobe peptides van integraal membraan eiwitten^13,14, evenals lipoproteïnen^9,10 . De methode heeft als extra voordeel van peptiden op basis van polariteit, zodat de tussenliggende wassen oplossingen kunnen worden geanalyseerd voor hoge vertrouwen eiwit identificatie gelijktijdig met N-terminale structurele bepaling in een enkele experiment . Dit protocol een unieke functies opzettelijke natrium adduct vorming te bevorderen van bovenliggende ion fragmentatie naar dehydroalanyl ionen tijdens MS/MS, helpend in structurele toewijzing van de N– acylering staat. De N-terminus is zowel de meest variabele en belangrijke functie gerelateerde TLR erkenning van lipoproteïnen. Tezamen, hebben dit protocol intensieve en reproduceerbare studies op lipoproteïnen, met de afzonderlijke fasen van zuivering en bepaling van de structurele door MALDI-TOF MS gemakkelijk aangepast afhankelijk van het algemene doel van het experiment.