Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento
Summary
Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Tradução do RNAm em proteínas é um processo complexo que envolve várias camadas do regulamento. Muitas vezes supõe-se que as alterações na transcrição de mRNA refletem alterações na síntese proteica, mas muitas exceções foram observadas. Recentemente, uma técnica chamada Ribossoma perfilação (ou Ribo-Seq) surgiu como um método poderoso que permite a identificação, com alta precisão, quais as regiões de mRNA são traduzidas em proteínas e quantificação de tradução a nível de todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo de generalizadas para quantificação de todo o genoma de tradução usando Ribo-Seq no fermento de brotamento. Além disso, combinar dados Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA nos permite quantificar simultaneamente a eficiência de conversão de milhares de transcrições de mRNA na mesma amostra e comparar alterações desses parâmetros em resposta a experimental manipulações ou nos diferentes Estados fisiológicos. Descreveremos um protocolo detalhado para geração de pegadas de Ribossoma usando digestão nuclease, isolamento de complexos de Ribossoma-pegada intacta através de fracionamento de gradiente de sacarose e preparação de bibliotecas de DNA para sequenciamento profundo juntamente com o apropriado controles de qualidade necessários para garantir uma análise precisa da tradução na vivo .
Introduction
Tradução de mRNA é um dos processos fundamentais na célula, que desempenha um papel importante na regulação da expressão da proteína. Portanto, a tradução de mRNA é rigidamente controlada em resposta a diferentes estímulos fisiológicos internos e externos, 1,2. No entanto, os mecanismos de regulação traducional permanecem pouco estudados. Aqui, descrevemos o protocolo para a quantificação de todo o genoma da tradução em leveduras brotamento pelo Ribossoma perfilação. O objectivo geral da técnica de criação de perfil ribossoma é estudar e quantificar a tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. Esta técnica usa o sequenciamento de próxima geração para analisar quantitativamente a ocupação do ribossomo ao longo do genoma e permite monitorar a taxa de proteína síntese na vivo no códon única resolução 3,4. Atualmente, este método fornece os meios mais avançados de medição dos níveis de tradução da proteína e provou para ser uma ferramenta de descoberta útil, fornecendo informações que não podem ser reveladas por outras técnicas atualmente disponíveis, por exemplo, microarrays ou Tradução estado matriz análise (TSAA) 5. Como o ribossoma relatórios sobre as alterações combinadas em níveis de transcrição e translação saída de criação de perfil, ele também fornece sensibilidade muito maior em comparação com outros métodos.
Esta abordagem baseia-se na profundo sequenciamento de fragmentos de mRNA ribossomo-protegido 3. Durante a tradução de proteínas, ribossomas proteger ~ 28 porções de nt do mRNA (chamado pegadas) 6. Determinando a sequência dos fragmentos protegidos Ribossoma, Ribo-Seq pode mapear a posição dos ribossomas no mRNA traduzido e identificar quais as regiões de mRNA são susceptíveis de ser ativamente traduzido em proteína 3,7. Além disso, quantitativamente podemos medir a tradução de mRNA pela contagem do número de pegadas que se alinham para uma determinado transcrição de mRNA.
Para isolar os fragmentos protegidos Ribossoma, lisados celulares são inicialmente tratados com um inibidor de tradução para enrolar os ribossomas seguidos por digestão ribonuclease. Considerando que livre mRNA e porções de mRNAs traduzidos não protegidos por ribossomos são degradadas pela ribonuclease, os fragmentos do mRNA ribossomo-protegido podem ser recuperados por purificar complexos Ribossoma-pegada intacta. Estas pegadas de mRNA são então convertidas em biblioteca de cDNA e analisadas por sequenciamento profundo (Figura 1). Em paralelo ao Ribossoma perfilação, mRNA intacta é extraído da mesma amostra e sequenciados. Comparando o nível de tradução identificado por Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA, podemos identificar os genes que são especificamente acima – ou para baixo-regulado ao nível da tradução e calcular a eficiência da tradução do mRNA a nível de todo o genoma. Enquanto o protocolo descrito neste artigo é específico para o fermento, é também útil para pesquisadores que tentarão estabelecer o protocolo Ribo-Seq em outros sistemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A abordagem de Ribo-Seq tem emergido como uma poderosa tecnologia de análise de mRNA tradução na vivo a todo o genoma de nível 3. Estudos utilizando esta abordagem, que permite o monitoramento de tradução com resolução de single-códon, tem contribuído para o nosso entendimento do Regulamento translacional. Apesar de suas vantagens, Ribo-Seq tem várias limitações. Fragmentos de RNA ribossómico (rRNA) são sempre co purificados durante o isolamento de pegadas Ribossoma-protegi…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenções de saúde AG040191 e AG054566 de VML. Esta pesquisa foi realizada enquanto VML foi bolseiro de investigação um AFAR da Federação Americana para pesquisa do envelhecimento.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
Referenzen
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