Para la medición cuantitativa de la proteína precursora del amiloide mediada por γ-secretasa y muesca hendidura en plataformas de ensayo reportero luciferasa basadas en células
Summary
Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.
Abstract
Hemos desarrollado un par de ensayos de gen reportero basadas en células para medir cuantitativamente la γ-secretasa escote de distintos sustratos. Este manuscrito describe los procedimientos que pueden utilizarse para monitorizar la γ-secretasa-mediada por hendidura del APP-C99 o muesca, utilizando un sistema de Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reportero. Estos ensayos fueron establecidos por estable Co transfectar las células HEK293 con el gen reportero de luciferasa Gal4-conducido y el fragmento de Gal4/VP16-etiquetadas C-terminal de APP (APP-C99; Células del CG), o el Gal4/VP16-tagged muesca-ΔE (NΔE; Células de NG). Mediante estos ensayos reportero en paralelo, hemos demostrado que un inhibidor ErbB2, CL-387.785, preferentemente puede suprimir la γ-secretasa hendidura del APP-C99 en células del CG, pero no NΔE en las células de NG. Las respuestas diferenciales exhibidas por las células del centro de gravedad y NG, con CL-387.785, representan una característica preferida para moduladores de la γ-secretasa, y estas respuestas están en marcado contraste con la pan-inhibición de la γ-secretasa inducida por DAPT. Nuestros estudios proveen evidencia directa que las actividades de la γ-secretasa hacia diferentes sustratos pueden diferenciarse en un contexto celular. Estos nuevos ensayos por lo tanto pueden ser herramientas útiles en el descubrimiento de fármacos para mejorar terapias de AD.
Introduction
Los formas de amiloide-β (Aβ) se creen que la causa primaria de la neurodegeneración en los cerebros de pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer (EA)1. Péptidos Aβ se producen por el paso a paso clivaje de la proteína precursora de amiloide (APP), primero por la β-secretasa y luego por la γ-secretasa2. En la última década, enfoques terapéuticos hacia el tratamiento de la EA se han centrado en la prevención de la producción de Aß3. La mayoría de los estudios se ha centrado en ambos el aumento de la actividad de la α-secretasa, que puede impedir la γ-secretasa escote de aplicación y disminuir así la producción de Aß y la inhibición de la γ-secretasa β-y/o actividades4. Desafortunadamente, la inhibición no selectiva de β o γ secretases resultados inevitables efectos secundarios son debido a la interferencia con el funcionamiento de otros substratos fisiológicos de β – y γ-secretasa5,6. Con respecto a los inhibidores de γ-secretasa, recientes estudios han reportado el descubrimiento de una serie de moduladores químicos y genéticos que regulan la producción de Aß y ejerciendo efectos insignificantes en el proceso esencial γ-secretasa-mediada de la muesca7 ,8,9,10,11,12, sin embargo, exitosa terapéutica aún no se han desarrollado. Por lo tanto, más sistemáticas pantallas están garantizados para descubrir nuevos modificadores genéticos y químicos que pueden modular selectivamente la γ-secretasa-mediada por el procesamiento de APP.
Γ-secretasa se sabe allegarse más de 90 diferentes proteínas ancladas a membrana. Entre estos sustratos es de clase, cuya actividad es fundamental para determinar el destino celular y diferenciación durante el desarrollo de13. Modulación selectiva aplicación de γ-secretasa-catalizada de procesamiento en ausencia de afectar la muesca procesamiento será esencial para reducir al mínimo muesca efectos secundarios de los inhibidores de γ-secretasa, y esta selectividad se cree que un factor primario que determinan la eficacia biológica de posibles moduladores de la γ-secretasa para el tratamiento crónico de AD. Ha habido una serie de derivados arylsulfonamide, como GSI-953 (begacestat) y BMS-708163 (avagacestat), que se han encontrado para exhibir potente y selectiva inhibición de la γ-secretasa14,15. Un estudio anterior ha demostrado que la inhibición diferencial de γ-secretasa hendidura del APP y muesca puede observarse utilizando un ensayo ELISA basado en combinación con validación en vivo utilizando el pez cebra16. Además, se han establecido paradigmas de análisis basadas en células para tratar la posible selectividad de substrato de γ-secretasa hacia la aplicación y muesca17,18. Utilizando protocolos similares a los descritos en este documento, recientemente hemos descubierto una nueva clase de (D)-leucinamides que potentemente modulan γ-secretasa hendidura del APP con muesca-escasamente selectividad19. En conjunto, esta colección de estudios proporciona una prueba de concepto apoyando la idea de que la selectividad del sustrato/disponibilidad de γ-secretasa puede ser objeto de modulación química y verificación experimental. Sin embargo, estas plataformas de ensayo a menudo dependen relativamente bajo rendimiento lecturas y enfoques que requieren mucho trabajo que no podrían cumplir con las normas industriales programas de descubrimiento de drogas.
Recientemente hemos generado ensayos de genética de reportero luciferasa basado en la célula que pueden determinar cuantitativamente la actividad catalítica de la γ-secretasa hacia dos sustratos diferentes, lo aminoácidos 99 fragmento c-terminal ácido de APP (APP-C99) y el extracelular eliminar dominio péptido de muesca (NΔE). APP-C99 y NΔE han sido ampliamente utilizados como sustratos directos de γ-secretasa en varios ensayos. Para generar ensayos de genética de reportero luciferasa homogénea y consistente para la hendidura de la γ-secretasa de aplicación-C99 o NΔE, hemos generado una línea de células estable HEK (CG) que expresa constitutivamente un Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) y proteína de la fusión de Gal4/VP16-etiquetada APP-C99 (C99-GV). Además, generamos otra línea de células estable HEK (NG) que expresa constitutivamente Gal4-Luc y Gal4/VP16-con la etiqueta NΔE (NΔE-GV). Utilizando estos ensayos de novela sustrato específico γ-secretasa, ahora proporcionan un método para cuantificar y para distinguir la actividad catalítica de la γ-secretasa hacia distintos sustratos (APP-C99 en células CG), o NΔE en las células de NG. Por otra parte, los ensayos de sustrato específico γ-secretasa fueron diseñados para ser propicio a plataformas de proyección de alto contenido. Estos ensayos recién generado γ-secretasa podrían allanar el camino para el descubrimiento de los moduladores de la novela de γ-secretasa que podría mejorar la función cognitiva mediante la supresión de producción de Aß sin producir inhibición de muesca indeseable para el tratamiento de última generación de AD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los resultados prometedores de un ensayo de 1b de fase de aducanumab la inmunoterapia para el anuncio han establecido firmemente el papel crítico de Aß en la patogenesia del anuncio22 y sugieren que los enfoques anti-Aß siguen siendo una estrategia viable para el desarrollo de fármacos anti-AD. Aquí, describimos ensayos basadas en células para la cuantificación de proteólisis catalizada por γ-secretasa de aplicación-C99 y NΔE utilizando sistemas de reportero de luciferasa de luciérnaga…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen las instalaciones centrales del Instituto de celular y biología organísmica, Academia Sinica, soporte técnico. Este estudio fue apoyado por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán (más 103-2320-B-001-016-MY3 a Y.-F. L.), el programa de innovación aplicada de desarrollo biofarmacéutico – tecnología de eje de plataforma de apoyo régimen (NP7 a F.L. Y.) y Academia Sinica (a Y.-F.L.).
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
Referenzen
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